鹿茸多肽對單側頸總動脈結扎所致輕度認知功能障礙模型大鼠的保護作用研究

劉玥欣，徐 巖 ，趙昕彤 ，李 鑫 ，周 佳 ，律廣富 ，林 賀 ，許佳明 ，黃曉巍 ，2

（1.長春中醫藥大學，長春130117；2.吉林省中藥生物大分子重點實驗室，長春130117）

輕度認知功能障礙 （Mild Cognitive Impairment，MCI）是正常人腦老化發展為阿爾茨海默病（Alzheimer's disease，AD）的過渡狀態，提早干預MCI對于降低AD的發病率具有重要意義[1]。中醫理論認為：腎藏精，主骨生髓，腦為髓海，年邁體弱，久病及腎，腎精虧虛，髓海失充，腦萎髓空，腦失所養，神機失用而出現呆證，宜采用填精補髓法治療腦病[2]。鹿茸為“生精補髓”之要藥，具有壯腎陽，補精髓等功效，主要有效物質為鹿茸多肽等[3]。腦源性神經營養因子(Brain Derived Neurotrophic Factor，BDNF）是成熟的中樞及周圍神經系統的神經元維持生存及正常生理功能的必需因子[4～5]，神經生長因子(Nerve Growth Factor，NGF）含對中樞及周圍神經元的發育、分化、生長、再生和功能特性的表達具有重要的調控作用[6～7]。本研究采用單側頸總動脈結扎法復制輕度認知功能障礙動物模型，通過觀察鹿茸多肽對模型大鼠行為學指標、血清、海馬組織中BDNF、NGF含量及表達水平的影響，探討鹿茸多肽對模型大鼠的保護作用機制。

1 實驗材料

1.1 動物及飼料

Wistar大鼠60只，體質量220±20g，由長春億斯實驗動物技術有限責任公司提供，許可證號碼：SCXK（吉）-2018-0007；鼠維持顆粒料，由長春億斯實驗動物技術有限責任公司提供，批號：20190322。

1.2 藥物及試劑

鹿茸多肽，由長春中醫藥大學中藥藥理學實驗室提供；吡拉西坦，東北制藥集團沈陽第一制藥有限公司，批號：6171256；BDNF、NGF、GAPDH 及 HRP 二抗，武漢三鷹生物技術有限公司，批號：11527-1-AP、13621-1-AP、10494-1-AP、15134-1-AP； 彩虹 245 廣譜蛋白Marker、全蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、ECL化學發光法檢測試劑盒，北京索萊寶科技有限公司，批號：PR1920、BC3710、PC0020、P1200、SW2010。

1.3 儀器

跳臺儀，上海欣曼科教設備有限公司，型號：DTT-2；4℃低溫離心機，德國Eppendorf艾本德股份公司，型號：Centrifuge 5810 R；電熱恒溫鼓風干燥箱，上海一恒科技有限公司，型號：DHG-9245A；酶標儀，賽默飛世爾（上海）儀器有限公司，型號：Multiskan FC；電泳儀，伯樂bio-rad有限公司，型號：BE6085；凝膠成像儀，英國UVItec有限公司，型號：Alliance Q9。

2 實驗方法

2.1 動物分組及模型復制[8]

60只大鼠隨機分為：假手術組，模型組，陽性對照組，鹿茸多肽高、中、低劑量組，每組10只。單側頸總動脈結扎法復制MCI動物模型具體方法如下：大鼠腹腔注射水合氯醛（0.35g·kg-1）麻醉后固定，頸前區刮毛、消毒，縱行切開皮膚后分離筋膜、肌肉、左側頸總動脈，用1號手術絲線永久性結扎左側頸總動脈，局部給予青霉素預防感染，縫合皮膚，假手術組不進行頸總動脈結扎其余手術同上。給予正常食水，飼養3d。

2.2 給藥方法[9～10]

假手術組、模型組給予同體積蒸餾水，陽性對照組給予500mg·kg-1吡拉西坦，鹿茸多肽高、中、低劑量組分別給予 300mg·kg-1、200mg·kg-1、100mg·kg-1鹿茸多肽。各組大鼠均給予正常食水，連續給藥18d。

2.3 鹿茸多肽對MCI模型大鼠行為學指標的影響[11]

利用跳臺實驗檢測各組模型大鼠行為學指標，具體方法：將大鼠放于避光箱中適應5min，通電（36V，3min），以受到電刺激作為錯誤反應評判標準，記錄各組大鼠逃避潛伏期、3min內錯誤次數。

2.4 鹿茸多肽對MCI模型大鼠血清中BDNF、NGF含量的影響

各組大鼠進行腹主動脈取血，4℃低溫離心機離心（4000r·min-1，5min），取上層血清，備用。依照 ELISA 試劑盒內說明檢測各組大鼠血清中BDNF、NGF含量。

2.6 鹿茸多肽對MCI模型大鼠海馬組織中BDNF、NGF表達水平的影響

將各組大鼠處死后，提取海馬組織-80℃冰箱保存備用。依照全蛋白提取試劑盒內說明提取各組大鼠海馬組織總蛋白，依照BCA蛋白濃度測定試劑盒內說明調節樣品蛋白濃度（濃度為2g·L-1），加入2倍體積樣品緩沖液后水浴 （100℃，5min），冷卻后備用。依照SDS-PAGE凝膠制備試劑盒內說明制備SDS-PAGE凝膠，在加樣孔中加入樣品 （20μL/孔），電泳（90V，30min；110V，60min），轉膜（100V，60min），洗滌 3 次后封閉（搖床60min），洗滌3次后封閉一抗（4℃過夜），洗滌3次后封閉二抗（搖床60min），洗滌3次后加入ECL發光液（孵育1min），取膜放置于凝膠成像儀中，記錄實驗結果，計算目標蛋白表達水平（目標蛋白表達水平=目的條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值）。

3 統計學方法

采用SPSS 17.0軟件進行統計學處理。結果以均數±標準差（x±s）表示，組間樣本均數比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

4 實驗結果

4.1 鹿茸多肽對MCI模型大鼠行為學指標的影響

跳臺實驗結果表明，與假手術組比較，模型組逃避潛伏期明顯升高 （P＜0.01）、3min內錯誤次數明顯增多（P＜0.01）；與模型組比較，陽性對照組、鹿茸多肽高、中、低劑量組逃避潛伏期明顯降低 （P＜0.05或P＜0.01），陽性對照組、鹿茸多肽高、中劑量組3min內錯誤次數明顯減少（P＜0.01）。結果見表1。0.05， P＜0.01。

表 1 跳臺實驗結果（n=10，x±s）

4.2 鹿茸多肽對MCI模型大鼠血清中BDNF、NGF含量的影響

ELISA實驗結果表明，與假手術組比較，模型組BDNF、NGF 含量均明顯減少（P＜0.01）；與模型組比較，陽性對照組、鹿茸多肽高、中、低劑量組血清中BDNF含量明顯增多（P＜0.01），NGF 含量明顯增多（P＜0.05 或P＜0.01）。 結果見表 2。

表 2 血清中 BDNF、NGF 含量比較（n=10，x±s）

4.3 鹿茸多肽對MCI模型大鼠海馬組織中BDNF、NGF表達水平的影響

Western Blot實驗結果表明，與假手術組比較，模型組 BDNF、NGF表達水平明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，陽性對照組、鹿茸多肽高、中、低劑量組BDNF、NGF表達水平明顯升高（P＜0.05）。 結果見表 3、圖1。

表 3 海馬組織中 BDNF、NGF 表達水平比較（n=10，x±s）

圖1 海馬組織中BDNF、NGF表達水平

5 結論

鹿茸為名貴中藥材，是吉林省道地藥材，資源極為豐富，在中醫腦病的治療方面具有悠久的歷史。明代李時珍在《本草綱目》中記載“鹿茸，生精補髓，養血益陽，強筋壯骨。治一切虛損，耳聾，目暗眩暈，虛痢”[12]。研究[13]表明，由大腦免疫系統引發的炎癥機制驅動了AD的惡化，也就是說MCI的發生與發展可能與機體免疫調節系統息息相關。本研究發現，采用單側頸總動脈結扎法復制的MCI模型大鼠學習記憶能力明顯降低，血清、海馬組織中BDNF、NGF含量及表達水平明顯降低；而陽性對照組、鹿茸多肽高、中、低劑量組均有所改善，說明鹿茸多肽對單側頸總動脈結扎法復制的MCI模型大鼠具有保護作用，作用機制可能與調控模型大鼠血清、海馬組織中BDNF、NGF含量及表達水平有關。