鹿茸多肽對冠脈結扎心肌缺血模型大鼠心肌特異性轉錄因子Nkx 2.5、GATA4、ATF-2和MEF-2C表達的影響

周 佳 ，徐 巖 ，律廣富 ，韓 冬 ，趙昕彤 ，王晉冀 ，王亞杰 ，王 宇 ，黃曉巍 ,2

（1.長春中醫藥大學，長春130117；2.吉林省中藥生物大分子重點實驗室，長春130117）

近年來，隨著生活節奏的提速，生活水平的提高，由于人們飲食結構不合理、生活習慣不規律等因素導致的心腦血管疾病患病幾率連年上升[1]。冠狀動脈粥樣硬化引起的缺血性心臟病嚴重威脅了人類的身心健康。心臟依賴血液的灌注來維持正常的生理活動，當血液的灌注減少或停止時，會導致心肌組織缺血缺氧、心肌細胞代謝紊亂、心肌功能異常甚至死亡。鹿茸作為我國傳統滋補類中藥，在保護心肌損傷、促進骨折愈合、提高機體免疫力、延緩衰老、改善記憶力等多方面具有良好的效果[2]。《本草經疏》記載鹿茸入心包，入心經；現代研究表明，鹿茸是哺乳動物中唯一可以完全再生的器官，可用于改善心臟功能；已有研究表明，鹿茸多肽可明顯緩解阿霉素所致的大鼠心肌損傷[3]。目前鹿茸多肽對冠脈結扎所致大鼠心肌缺血損傷研究較少。本實驗從鹿茸多肽影響心肌特異性轉錄因子NK型同源盒基因轉錄因子2.5(NKx2.5)、鋅指蛋白轉錄因子4（GATA4）、激活轉錄因子 2（ATF-2）、肌細胞特異性增強因子-2C(MEF-2C)表達水平的角度出發，對鹿茸多肽預防和治療冠脈結扎大鼠心肌缺血的作用機制進行研究。

1 材料

1.1 實驗動物

標準Ⅱ導聯心電圖正常的Wistar大鼠60只，雌雄各半，體質量（270±20）g，長春市億斯實驗動物技術有限責任公司提供，實驗動物生產許可證號：SCXK(吉)-2016-0003。常規飼養，適應性喂養3d后用于實驗。

1.2 實驗藥物

鹿茸多肽：長春中醫藥大學提供；輔酶Q10膠囊：海上藥信誼藥廠有限公司 （國藥準字H19999132）；Nkx 2.5Elisa kit：上海酶聯生物科技有限公司（批號：ml2227618）；GATA4、ATF-2、MEF-2CElisa kit：酶免生物科技有限公司 （MM-20697R1、MM-0837R1、MM-0834R1）；蘇木素伊紅（HE）染色試劑盒：上海碧云天生物科技有限公司，貨號：C0105。

2 儀器

大鼠固定器、ML870PowerLab數據采集分析系統、Multiskan FC酶標儀、生物組織自動脫水機、生物組織自動包埋機。

3 實驗方法

3.1 動物分組及給藥

隨機將大鼠分成6組，即假手術組、模型組、陽性對照組、鹿茸多肽高、中、低劑量組，每組10只。假手術組、模型組給予等體積蒸餾水，陽性對照組給予輔酶Q10膠囊3mg·kg-1，鹿茸多肽高、中、低劑量組大鼠分別給予鹿茸多肽 300、200、100mg·kg-1。 實驗動物自由飲食飲水，連續給藥28d。

3.2 模型復制

參照文獻[4]，大鼠稱重后，腹腔注射水合氯醛麻醉后結扎心臟左冠狀動脈前降支，對比大鼠術前術后心電圖，符合典型心梗表現者視為手術成功，存活者列入模型組、給藥組。假手術組僅開胸，不結扎冠狀動脈[5]。

3.3 檢測指標

3.3.1 心電檢測[6]

末次給藥30min后，乙醚麻醉大鼠，固定于大鼠固定器上，連接八通道生物信號采集處理系統，記錄2min內的大鼠心電圖和心率，心電圖基線設為PR段，比較各組心電圖ST段的變化和心率變化。

3.3.2 Elisa法檢測各組大鼠血清中 Nkx2.5、GATA4、ATF-2和MEF-2C含量

檢測心電30min后，4%水合氯醛麻醉大鼠，打開腹腔，腹主動脈取血[7]，靜置 20min，3 500r·min-1離心15 min，取血清，按照試劑盒說明書檢測大鼠血清中Nkx2.5、GATA4、ATF-2和 MEF-2C 的含量。

3.3.3 HE染色觀察大鼠心肌組織損傷情況

將固定后的心肌組織脫水、石蠟包埋，切成5μm薄片，HE染色，光學顯微鏡下觀察各組大鼠心肌組織形態學變化[8]。

3.4 統計學方法

采用SPSS17.0統計分析軟件進行數據處理，計量資料均采用表示，多組均數組間比較采用單因素方差分析，顯著性水準P=0.05。

4 實驗結果

4.1 各組大鼠心率及心電圖ST段變化

與假手術組比較，模型組心率明顯上升、ST段明顯升高，差異具有統計學意義（P<0.01）。與模型組比較，陽性對照組、鹿茸多肽高、中、低劑量組明顯降低，差異具有統計學意義（P<0.05或P<0.01），結果見表1。

表1 各組大鼠心率及心電圖ST段變化（x±s）

4.2 各組大鼠血清中Nkx 2.5、GATA4、ATF-2和MEF-2C含量變化

與假手術組比較，模型組大鼠血清中Nkx 2.5、GATA4和MEF-2C含量顯著降低，差異具有統計學意義（P<0.05或P<0.01）。與模型組比較，陽性對照組、鹿茸多肽高、中、低劑量組大鼠血清中Nkx 2.5、GATA4和MEF-2C含量顯著升高，差異具有統計學意義（P<0.05或P<0.01），其中鹿茸多肽低劑量組與陽性對照組比較，血清中Nkx 2.5和MEF-2C含量顯著升高，差異具有統計學意義（P<0.05）。與模型組比較，各組大鼠血清中ATF-2含量無明顯變化，差異無統計學意義（P>0.05），結果見表 2。

表2 各組大鼠血清中Nkx 2.5、GATA4、ATF-2和MEF-2C 含量變化（x±s）（ng/L）

4.3 各組大鼠心肌組織病理學觀察

HE染色結果表明，假手術組大鼠心肌組織結構規則，紅色部分心肌組織排列整齊，細胞核大小、形態無明顯差別，清晰可見，心肌細胞間隙均勻，無炎性細胞浸潤。與假手術組比較，模型組組織壞死比例較高，心肌纖維排列紊亂并有溶解斷裂，核細胞深染，可見明顯炎性細胞浸潤，成纖維細胞增生明顯。隨著鹿茸多肽給藥劑量的增加，心肌細胞溶解減輕，心肌纖維排列較為整齊，細胞間隙變小，炎性細胞浸潤減少。詳見圖1。

圖1 各組大鼠心臟組織HE染色結果（×200）

5 討論

據統計[9]，我國14億人口中約有2.9億人患有心血管疾病，城鄉居民死亡原因中，有40%以上是由于心血管病死亡，高于腫瘤等其他疾病。防治心血管病已經成為中國目前重大的公共衛生問題，對心血管疾病的防治迫在眉睫[10]。

在探討藥物在治療心肌梗死的療效及作用機制中，復制相對精準的心肌梗死動物模型至關重要，本研究采用結扎大鼠左冠狀動脈前降支的方法復制心肌缺血的發生發展，可以保證梗死部位相對固定，在盡量避免個體差異的同時，提高模型動物的成活率，并最大限度地模擬臨床上心肌梗死的病理過程[11]。實驗結果表明，對比假手術組和模型組，大鼠心率和心電圖ST段的變化符合心肌缺血造模的各項指標，表明實驗造模成功[12]。

《神農本草經》中將鹿茸列為中品，中醫使用鹿茸防治各類疾病已有兩千余年的歷史[13]。現代藥理學研究表明，鹿茸中含有多種有效成分，其中多肽、蛋白質在鹿茸的藥用中占有重要的地位[14]。已有研究證實，鹿茸多肽能夠有效減少心肌梗死面積，使缺血區域血管收縮程度減輕，改善血液循環，從而減少心肌梗死后缺血缺氧對心肌細胞的損傷[15～16]。 Nkx2.5，GATA4，ATF-2，MEF-2C是心臟在早期發育過程中表達的轉錄因子[17]，起到調控心臟結構蛋白基因表達、促進細胞分化方向的作用，在心臟的發育過程中起著重要作用[18]。其中，Nkx2.5在環化、分化、間隔功能成熟、維持傳導系統等過程中參與了心臟的形成[19]；GATA4在心肌存活和心臟肥大中起重要作用；ATF-2、MEF-2C可以在自身維持、損傷修復等方面調控心臟特異性調控蛋白。

本研究以鹿茸多肽為研究對象，觀察其對冠脈結扎大鼠心肌損傷的修復作用。結果表明，鹿茸多肽可明顯保護冠脈結扎大鼠的心肌損傷，恢復心率，調整ST段上調幅度，其作用機制可能與提高Nkx 2.5、GATA4和MEF-2C的水平有關，而ATF-2無明顯變化。