不同產(chǎn)地兩頭尖藥材的薄層色譜指紋圖譜研究

趙麗茹 ，曲 帥 ，李金花 ，吳海英 ，趙利利 ，蔡廣知

（1.吉林省生物研究所，長春130012；2.長春中醫(yī)藥大學(xué)，長春130017）

兩頭尖藥材為毛茛科植物多被銀蓮花Anemone raddeana Regel的干燥根莖，性辛，熱,有毒。歸脾經(jīng)。具有祛風(fēng)濕，消癰腫的功效[1]。已經(jīng)報道的兩頭尖的藥理作用有抗腫瘤、抑菌、鎮(zhèn)靜等[2]，臨床上被廣泛應(yīng)用。兩頭尖中含有皂苷類、內(nèi)酯類、揮發(fā)油等成分[3]。而已經(jīng)發(fā)表的關(guān)于兩頭尖藥材的文獻(xiàn)，質(zhì)量研究方面的報道很少。筆者研究團(tuán)隊在兩頭尖藥材的質(zhì)量研究方面做了許多工作，包括兩頭尖的高效液相指紋圖譜研究[4]，兩頭尖中竹節(jié)香附素A的含量測定研究[5]，兩頭尖的紅外光譜及紫外光譜研究。本文采用薄層色譜法對不同產(chǎn)地的兩頭尖藥材進(jìn)行了鑒別研究。

1 試藥、試劑與儀器

1.1 試藥與試劑

竹節(jié)香附素A對照品，中國藥品生物制品檢定所；甲醇（分析純）、乙醚、正丁醇，北京化工廠；蒸餾水，自制；硅膠G薄層板（10×10），青島海洋化工廠。

1.2 儀器

CAMAG LINOMAT 5半自動點樣儀、CAMAG TEPROSTAR 3照相儀、CAMAG TLC SCANNER自動掃描儀，均購置瑞士卡瑪生化公司。

1.3 中藥兩頭尖藥材產(chǎn)地

兩頭尖藥材經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)肖寄平教授鑒定均為毛莨科銀蓮花屬多被銀蓮花 （Anemone raddeana Regel）的干燥根莖，其產(chǎn)地詳情見表1。

表1 兩頭尖藥材產(chǎn)地

1.4 混淆品

包括三個混淆品：天葵子、九節(jié)菖蒲、香附。

2 實驗方法

2.1 薄層色譜條件

薄層板：預(yù)制硅膠G薄層板（110℃活化0.5h）

點樣量：供試品溶液和對照品溶液各2μL

展開系統(tǒng)：三氯甲烷-甲醇-水（7∶3∶1）的下層溶液

檢測方式：噴以顯色劑10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰，觀察。

掃描條件：雙波長掃描，測定波長λR=525nm λS=700nm

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液的制備

稱取不同產(chǎn)地的兩頭尖藥材粉末 （過80目篩）約5g，精密稱定，置錐形瓶中，加10倍量甲醇，封口，超聲提取40min，過濾，濾液回收溶劑至干，殘渣加水10ml溶解，用乙醚振搖提取 2次（分別為 20ml、10ml），棄去乙醚液。水液用水飽和正丁醇振搖提取5次 （分別為20ml、20 ml、15 ml、15 ml、15 ml），合并正丁醇液，減壓回收溶劑至干。殘渣加適量甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至10ml量瓶中，再加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得[6]。

2.2.2 對照品溶液的制備

精密稱取竹節(jié)香附素A對照品適量，制成每1ml甲醇約含0.1mg的溶液，搖勻，即得。

2.3 色譜條件的優(yōu)選

2.3.1 展開劑的優(yōu)選

曾用的展開劑有乙酸乙酯-甲醇-水（6∶4∶1），三氯甲烷-甲醇(7∶4)及三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(2.5∶1∶1∶0.1)，三氯甲烷-甲醇-水（7∶3∶1）。 結(jié)果以三氯甲烷-甲醇-水（7∶3∶1）的下層溶液為展開劑時，斑點清晰，無拖尾現(xiàn)象。而且斑點間分離度好，R f重現(xiàn)性也較好，故選用三氯甲烷-甲醇-水（7∶3∶1）的下層溶液為展開劑[7]。

2.3.2 顯色劑的優(yōu)選

曾選用10%硫酸乙醇試液(105℃加熱)、10% 磷鉬酸乙醇試液(105℃加熱)和香草醛濃硫酸溶液等為顯色劑。結(jié)果表明，其他顯色劑或是斑點較少或是斑點不清晰，而以10%硫酸乙醇試液(105℃加熱)作為顯色劑，斑點清晰穩(wěn)定。故而最終選擇10%硫酸乙醇試液為顯色劑[8]。

2.4 方法學(xué)驗證

2.4.1 精密度考察

取同一供試品溶液，在同一薄層板上連續(xù)點樣5次，測定竹節(jié)香附素A的Rf值和峰面積，并計算RSD，結(jié)果Rf值均值為0.268，RSD值為3.12%(n=6)。峰面積均值為232.78，RSD值為0.12%(n=5)。由精密度相關(guān)系數(shù)評價結(jié)果表明，本儀器的精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性考察

取同一供試品溶液， 分別在 0，4，8，12，24h 測定。測定竹節(jié)香附素A的Rf值和峰面積，并計算RSD，結(jié)果Rf值均值為0.252，RSD值為1.77%(n=6)。峰面積均值為234.88，RSD值為0.15%(n=5)。由穩(wěn)定性考察結(jié)果表明，本方法穩(wěn)定性良好。

2.4.3 重現(xiàn)性考察

取同一產(chǎn)地供試品5份，按照供試品溶液的制備方法進(jìn)行處理，測定竹節(jié)香附素A的Rf值和峰面積，并計算RSD，結(jié)果Rf值均值為0.268，RSD值為1.67%(n=6)。峰面積均值為234.66，RSD值為1.02%(n=6)。由重現(xiàn)性考察結(jié)果表明，本方法重現(xiàn)性良好。

2.5 薄層指紋圖譜的建立

2.5.1 薄層色譜圖的直觀分析

依照上述實驗方法進(jìn)行測定[9]，得到兩頭尖的薄層色譜指紋圖譜以及混淆品的薄層色譜圖，結(jié)果見圖1、2、3。

圖1 不同產(chǎn)地兩頭尖薄層色譜圖1

圖2 不同產(chǎn)地兩頭尖薄層色譜圖2

圖3 不同產(chǎn)地兩頭尖薄層色譜圖3

由以上薄層色譜圖的可以看出，樣品斑點清晰，顏色深淺不同，而3個混淆品的斑點情況跟兩頭尖樣品則存在較大的差異，基本沒有達(dá)到分離效果。

2.5.2 薄層色譜圖的掃描分析

依照上述薄層掃描的參數(shù)設(shè)置，將獲得的薄層色譜圖進(jìn)行薄層掃描，得到兩頭尖的薄層掃描圖以及混淆品的掃描圖，結(jié)果見圖 4、5、6。

圖4 薄層掃描圖1

圖5 薄層掃描圖2

圖6 薄層掃描圖3

將掃描結(jié)果進(jìn)行分析總結(jié)，用峰高來代表樣品中的出峰情況，0代表未出峰，峰高單位AU，總結(jié)見表2-1和表2-2。

表2 -1 18批兩頭尖薄層掃描結(jié)果

表2 -2 18批兩頭尖薄層掃描結(jié)果

從表中可以看出，18個不同正品藥材共有5個共有峰，分別是 1，3，4，5，20 號峰。 其中 5 號峰為對照品竹節(jié)香附素A，它雖在各個樣品中均出峰，但峰高不一，表明竹節(jié)香附素A在各個樣品中的含量差異較明顯。各個產(chǎn)地的兩頭尖藥材除了具有5個共有峰外，其余出峰的個數(shù)和峰面積積分值都有所不同。

3 結(jié)論

本文采用薄層掃描法對不同產(chǎn)地的兩頭尖藥材進(jìn)行測定，建立中藥兩頭尖的薄層色譜指紋圖譜。對薄層板進(jìn)行直觀分析，可以看出，各個樣品出現(xiàn)的斑點明顯，而3個混淆品的斑點情況跟兩頭尖樣品則存在較大的差異，說明在此展開系統(tǒng)中，混淆品基本上沒有達(dá)到分離的效果，通過觀察薄層板，可以很快的對樣品和混淆品進(jìn)行鑒別。薄層掃描結(jié)果顯示所有兩頭尖樣品共出峰20個，根據(jù)出峰情況把18個樣品大致分為7類，出峰的差異較明顯。說明不同產(chǎn)地的兩頭尖藥材存在差異。結(jié)果表明，薄層色譜掃描法可以作為兩頭尖質(zhì)量控制的一種可靠方法。