快速溶劑萃取儀提取人參多糖的工藝研究

王國明，徐清華，徐芳菲，李 蕾，謝麗娟，郭暢冰，查 琳，楊懷雷，曹志強

（吉林人參研究院·吉林通化·134001）

人參（Panax ginseng C.A.Mey.）為五加科植物的干燥根及根莖，具有大補元氣、復脈固脫、補脾益肺、生津養(yǎng)血、安神益智的功能[1]。人參多糖是人參重要的活性成分，發(fā)揮著重要作用。現(xiàn)代藥理研究表明，人參多糖具有生物免疫調(diào)節(jié)功能，如抗腫瘤、抗疲勞、抗衰老、預防老年癡呆、調(diào)節(jié)血糖及血脂[2～12]等。近年來有關(guān)植物多糖的化學結(jié)構(gòu)、生物功能和提取工藝等方面的研究越來越多，目前為止，多糖的提取方法有熱水浸提法、酶提取法、微波輔助提取法、溶劑提取法、超聲波提取法等[13～16]。快速溶劑萃取與其他提取法相比，可有效提高提取分離率，縮短提取時間、節(jié)約成本，甚至還可以提高產(chǎn)品的質(zhì)量和產(chǎn)量，而且因為該提取方法是一個物理變化過程，能在一定時間內(nèi)保持多糖性質(zhì)的穩(wěn)定。其研究受到了廣泛關(guān)注[17]。

快速溶劑萃取技術(shù)（Fully Automatic Rapid Solvent Extraction，APLE）是一種專用于固體、半固體樣品的快速樣品預處理裝置，萃取時間為幾分鐘至數(shù)十分鐘，溶劑消耗為幾毫升至幾十毫升，整個操作過程均采用完全密閉處理，有效的減少了有機溶劑的揮發(fā)，以及實驗室人員接觸有機蒸汽的時間，環(huán)境友好，健康安全。它是近年來剛剛發(fā)展起來的技術(shù)，因其具有提取效率高、在線凈化、快速和節(jié)省溶劑的特點，已被美國國家環(huán)保局（EPA）寫入標準方法。近年來，國內(nèi)也在快速溶劑萃取前處理技術(shù)上開展大量的研究，快速溶劑萃取技術(shù)已經(jīng)被國家標準(GB/T 19649－2006)指定為樣品萃取技術(shù)，然而用快速溶劑萃取法提取人參多糖的文獻報道較少，因此該技術(shù)在人參多糖成分的提取還有很大的發(fā)展空間，還需要進行細致深入的研究工作。

本文將利用快速溶劑萃取法提取人參多糖，從萃取壓力、加熱溫度、萃取時間、循環(huán)次數(shù)為輔助指標，建立人參多糖的最佳提取條件，以期對以后的研究有借鑒價值。

1 材料與方法

1.1 材料

材料與試劑 ：人參藥材（吉林省通化地區(qū)），葡萄糖（國藥集團），苯酚（北京化工廠），濃硫酸（北京化工廠）。

儀器與設(shè)備：快速溶劑萃取儀（APLE-2000北京吉天有限公司），紫外可見分光光度計（上海光譜儀器設(shè)備有限公司SP-1920），電子天平 （賽多利斯SQP型），離心機（湖南湘儀TDZ5-WS），圓周振蕩器（德國IKA Lab-Dancer），真空干燥箱（上海慧泰 DZF-6050），數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇白塔HH-6）。

1.2 實驗方法

1.2.1 試樣預處理

將人參清洗后置于真空干燥箱內(nèi)烘干至質(zhì)量恒定，之后用中藥粉碎機進行粉碎，過100目篩，粉末置于密封袋內(nèi)保存?zhèn)溆谩７Q取300g樣品加入95%乙醇6000mL，加熱浸提2h，抽濾，棄去濾液，除去色素、脂質(zhì)類及溶于醇的雜質(zhì)。濾渣60℃烘干即得人參試樣。

1.2.2 APLE提取人參多糖

稱取1g人參試樣，與2g硅藻土充分混合，裝入萃取池，再用適量硅藻土填充萃取池，以蒸餾水為溶劑，設(shè)計不同的加熱溫度、循環(huán)次數(shù)、萃取壓力、萃取時間，開始快速萃取。萃取完成后，取出收集瓶，加水定容至100mL，待測。

1.2.3 熱水輔助提取人參多糖

稱取人參試樣3g，按照1∶30的料液比進行90℃加熱浸提，提取時間分別為2h、1h、1h，離心后將上清液合并，加水定容至300ml，待測。

1.2.4 超聲波輔助提取人參多糖

稱取人參試樣3g，加90ml水浸泡6h，超聲溫度為70℃，超聲功率為50kHz，超聲40min，離心后將上清液合并，加水定容至300ml，待測。

1.3 人參多糖含量的測定

1.3.1 葡萄糖標準曲線繪制

配置濃度為10mg/mL的無水葡萄糖標準溶液，用前稀釋50倍為使用液。精密吸取葡萄糖標準使用液0、325、650、975、1300、1625 μL 置于 50mL 試管中（相當于質(zhì)量為 0、65、130、195、260、325μg）， 補加水至2.0mL，加入5%苯酚溶液1.0mL，在圓周振蕩器混勻，小心加入濃硫酸10.0mL，在圓周振蕩器小心混勻，置沸水浴中加熱2min，取出，冰浴2min，冷卻至室溫，于485nm波長處以試劑空白未參比測定吸光度。以吸光度（A）為縱坐標，葡萄糖質(zhì)量為橫坐標繪制標準曲線，詳見圖1，得到回歸方程為：y=3.002x+0.010（R2=0.999）。

圖1 葡萄糖標準曲線Fig.1 Standard curve of glucose

1.3.2 人參多糖試樣含量測定

準確量取5mL于離心管中，加入20mL無水乙醇，置于冰箱冷藏4h以上，3500r/min離心5min，棄去上清液，緩慢加入10mL 80%乙醇洗滌沉淀，再次離心，棄去上清液，反復操作3次，殘渣揮干后加水溶解，定容至25mL，精密量取該溶液1mL，補加水至2.0mL，加入5%苯酚溶液1.0mL，在圓周振蕩器混勻，小心加入濃硫酸10.0mL，在圓周振蕩器小心混勻，置沸水浴中加熱2min，取出，冰浴2min，冷卻至室溫，于485nm波長處以試劑空白未參比測定吸光度。計算多糖提取率（%）。

式中，X為樣品中粗多糖含量（%）;

m1為被測液葡萄糖質(zhì)量（mg）;

m2為樣品稱樣質(zhì)量（g）;

V1為樣品提取液體積（mL）;

V2為沉淀粗多糖所用提取液體積（mL）;

V3為粗多糖液體積（mL）;

V4為比色管中測定液吸取體積（mL）;

0.9 為葡萄糖換算為粗多糖換算系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 APLE萃取多糖的單因素實驗

2.1.1 萃取壓力的確定

APLE2000快速溶劑萃取儀分別設(shè)計不同萃取壓力 6、8、10、12、14、16MPa， 結(jié)果見圖 2。 提取壓力為8Mpa時，提取率最高，壓力繼續(xù)增大，多糖提取率逐漸降低。因此，8Mpa為最佳萃取壓力。

圖2 萃取壓力對人參多糖提取率的影響Fig.2 Effect of pressure on polysaccharide yield in Chinese chestnut

2.1.2 循環(huán)次數(shù)的確定

APLE2000快速溶劑萃取儀分別設(shè)計循環(huán)1次、2次、3次、4次、5次開始快速萃取。萃取完成后，取出收集瓶，加水定容至100mL，結(jié)果見圖3，隨著循環(huán)次數(shù)增多，人參多糖提取率逐漸升高，因此，選定的正交實驗循環(huán)次數(shù)分別為3、4、5次。

圖3 循環(huán)次數(shù)對人參多糖提取率的影響Fig.3 Cycle times on polysaccharide yield in Chinese chestnut

2.1.3 提取時間的確定

APLE2000 快速溶劑萃取儀分別設(shè)計 1、3、6、9、12min開始快速萃取。萃取完成后，取出收集瓶，加水定容至100mL，結(jié)果見圖4，隨著提取時間增加，人參多糖提取率逐漸升高，6min之后趨于平穩(wěn)，6、9、12min的多糖提取率相差不大，為了節(jié)約時間成本，因此，選定的正交實驗循環(huán)次數(shù)分別為6、7、8min。

圖4 提取時間對人參多糖提取率的影響Fig.4 Effcet of time on polysaccharide yield in Chinese chestnut

2.1.4 加熱溫度的確定

APLE2000快速溶劑萃取儀分別設(shè)計不同加熱溫度 60、80、100、120、140、160℃開始快速萃取， 循環(huán) 2次。萃取完成后，取出收集瓶，加水定容至100mL，結(jié)果見圖5，提取過程中，溫度過低，溶劑的滲透能力和溶解能力較低，多糖不易滲出；溫度過高，不僅消耗熱量較高，提取液中雜質(zhì)也隨著增加，另外多糖活性也會降低。如下圖可見，人參多糖提取率隨著溫度的增加而增加，一方面可能是因為加熱導致分子的運動加快，溶質(zhì)之間的碰撞增加，細胞壁溶脹破碎增加。另一方面可能是因為隨著溫度的增高，多糖的晶態(tài)高聚物轉(zhuǎn)變?yōu)榉蔷B(tài)后，溶劑分子滲入到多糖高分子內(nèi)部而逐漸溶解多糖，從而提高了提取率，但高溫會使人參淀粉糊化，人參淀粉降解成單糖[18]。因此，選定的正交實驗循環(huán)次數(shù)分別為 100、1201、140℃。

圖5 提取溫度對人參多糖提取率的影響Fig.5 Effcetoftemperture on polysaccharide yield in Chinese chestnut

2.2 APLE萃取人參多糖正交實驗工藝優(yōu)化

在單因素基礎(chǔ)上，萃取壓力為8Mpa，對加熱溫度，循環(huán)次數(shù)，萃取時間為進行考察，進行L9（34）正交實驗，獲得最佳提取工藝，正交實驗具體因素水平如表1所示。正交實驗結(jié)果見表2，3個因素對人參多糖提取率的影響次序為加熱溫度＞循環(huán)次數(shù)＞萃取時間，根據(jù)顯著性檢驗確定的最佳提取工藝條件為A3B3C2。即加熱溫度為140℃，循環(huán)次數(shù)為5次，萃取時間為9min。由方差分析表3可知，加熱溫度對多糖的提取了的影響顯著，循環(huán)次數(shù)和萃取時間對多糖提取率影響不顯著。

表1 正交實驗設(shè)計的因素與水平Table 1 Factors and levels in orthogonal esperimental design

表2 人參多糖提取正交實驗結(jié)果Table 2 Orthogonal test results of polysaccharide extraxtion in Panax Ginseng

表3 方差分析結(jié)果Table 3 Result of variance anaysis

圖6 效應曲線圖Fig.6 Effect diagram

2.3 驗證性實驗結(jié)果

為了驗證正交實驗結(jié)果的可靠性，根據(jù)最佳提取條件進行了3次平行驗證性實驗，在加熱溫度140℃，循環(huán)次數(shù)為5次，萃取時間為9min的條件下，人參多糖的實際提取率分別為11.18%、11.39%、11.29%，表明該工藝穩(wěn)定可行，具有實際應用價值。

2.4 三種人參多糖提取方法的比較

根據(jù)正交實驗所確定的APLE萃取人參多糖的最佳條件進行多糖提取，結(jié)果得出，人參多糖的提取率為11.36%，與熱水輔助提取、超聲波輔助提取法進行比較，結(jié)果見表4。APLE提取人參多糖含量與超聲波提取含量差別不大，是傳統(tǒng)熱水輔助提取人參多糖含量的1.7倍，快速溶劑萃取法用時最短，提取溶劑用量少，提取率高，是一種綠色高效的提取技術(shù)，其他兩種方法用時、用量均比快速溶劑萃取法高，可見APLE萃取法可以為人參多糖的提取提供一種新方法。

表4 不同提取方法比較Table 4 Comparison of different extraction methods

3 結(jié)論

本實驗結(jié)果表明，APLE快速溶劑萃取人參多糖的最佳工藝為加熱溫度為140℃，循環(huán)次數(shù)為5次，萃取時間為9min。在最優(yōu)條件下，人參多糖提取率為11.36%，APLE法和超聲波輔助提取所得粗多糖的含量差別不大。與水提法相比，樣品處理時間由4 h降低至約0.5 h，大幅度提高樣品處理效率，并且人參多糖提取率提高了70%。

快速溶劑萃取技術(shù)在加壓加溫條件下進行樣品提取，分子運動能力提高，擴散加強，在提取過程中溶劑始終保持液態(tài)，保證其與樣品有最大接觸面積，且溶劑粘度降低易于進入樣品基質(zhì)，在高溫條件下從而加速提取過程，完成1次提取一般僅需27 min；萃取時間縮短了，可以保證萃取物熱降解減少；溶劑用量少，1g樣品僅需60 mL溶劑，操作使得提取步驟只發(fā)生在同一個萃取池，避免了傳統(tǒng)方法由于過濾、轉(zhuǎn)移等操作而造成的樣品損失；萃取效率高，顯著降低了單個樣品的提取成本；而且使用方便，安全性好，自動化程度高，APLE法是一種有效的人參多糖提取方法，對人參多糖的工藝研究具有一定的實際價值。