胰腺癌患者外周血CD4+T亞群細胞因子及轉錄因子的表達及其臨床意義

劉嫣方，付敏，劉海冰，尹亮，王冬青

(1. 江蘇大學附屬人民醫院中心實驗室，江蘇 鎮江 212002； 2. 江蘇大學醫學院，江蘇 鎮江 212013； 3. 江蘇大學附屬人民醫院檢驗科，江蘇 鎮江 212002； 4. 江蘇大學附屬人民醫院普外科，江蘇 鎮江 212002； 5. 江蘇大學附屬醫院影像科，江蘇 鎮江 212001)

利用效應T細胞殺滅腫瘤細胞的免疫療法，尤其是針對免疫檢查點例如程序性死亡蛋白1和細胞毒性T淋巴細胞抗原-4的抑制在黑色素瘤和非小細胞肺癌等腫瘤的治療中獲得了較好的臨床效果[1-2]。但是，臨床研究表明，現有的免疫檢查點治療并沒有抑制胰腺癌的進展或延長患者的總體生存率，其中重要原因就是胰腺癌具有高度免疫抑制性的腫瘤微環境[3]。免疫細胞及炎癥因子是腫瘤微環境的重要組成部分，在腫瘤相關免疫應答中起重要作用。CD4+輔助性T細胞(Th)是腫瘤免疫應答的核心成員，目前CD4+T細胞亞群在胰腺癌發生發展過程中的生物學作用尚不完全清楚。因此，本研究擬通過檢測胰腺癌患者外周血中Th1、Th2、Th17和Treg細胞相關細胞因子及轉錄因子水平，探討CD4+T細胞亞群在胰腺癌腫瘤免疫中的作用及其臨床意義。

1 對象和方法

1.1 研究對象

選取2018年5月至2019年7月于鎮江市第一人民醫院普外科及腫瘤科就診的胰腺癌患者27例作為胰腺癌組，其中男15例，女12例，年齡39～80歲，平均(57.86±10.48)歲；胰頭癌18例，胰體尾癌9例。按照國際抗癌聯盟(UICC)制定的TNM分期標準：Ⅰ期5例、Ⅱ期7例、Ⅲ期3例和Ⅳ期12例。所有患者術前未接受放療化療及免疫學治療，排除自身免疫性及感染性疾病，術后病理學證實為胰腺癌。另外選取同期30例健康體檢者作為對照組，其中男17例，女13例，年齡26～84歲，平均(52.35±11.21)歲。對照組與胰腺癌組年齡與性別無差異，具有可比性。

本研究方案獲鎮江市第一人民醫院倫理委員會批準，患者簽署知情同意書。

1.2 外周血血清及單個核細胞分離

清晨采集受試者空腹肘靜脈血2 mL于無菌真空干燥管中，靜置待血液凝固，2 500 r/min離心5 min，小心吸取血清，于-80 ℃保存備用。

另采集肘靜脈血2 mL于EDTA抗凝管中，搖勻；取3 mL淋巴細胞分離液，沿管壁緩緩加入血液樣本，使血液置于分離液液面上；水平離心機2 000 r/min離心20 min；小心吸取分離液層及淋巴細胞層于另一新離心管，PBS洗滌2次；于-80 ℃保存備用。

1.3 ELISA法檢測血清中細胞因子含量

用ELISA法檢測IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10、IL-17、TGF-β含量。所有試劑盒均為美國R&D Systems公司產品。操作步驟按照試劑盒說明書進行，酶標儀450 nm測光密度值，利用標準曲線計算樣本含量。

1.4 實時熒光定量PCR法檢測相關轉錄因子mRNA的表達

取出凍存的外周血單個核細胞，加入1 mL Tri-zol裂解，提取細胞總RNA。利用TaKaRa公司反轉錄試劑盒合成模板cDNA，操作步驟按試劑盒說明書進行；合成的cDNA即刻行PCR或保存于-20 ℃備用。

定量PCR(美國應用生物系統公司7300擴增儀)體系共20 μL：SYBR premix exTaq10 μL、上游引物(10 μmol/L)0.8 μL、下游引物(10 μmol/L)0.8 μL、ROX reference Dye(50×) 0.4 μL、cDNA 2 μL、雙蒸水6 μL。以β-肌動蛋白作為內參基因，采用2-ΔΔCT法計算目的基因相對表達水平。反應條件：94 ℃預變性5 min，然后94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，80 ℃熒光收集30 s，共進行40個循環。引物序列見表1。

1.5 統計學分析

表1 各轉錄因子引物序列

2 結果

2.1 兩組Th1類及Th2類細胞因子與轉錄因子水平比較

與對照組相比，胰腺癌組Th1類細胞因子IL-2(t=4.889，P<0.01)及IFN-γ含量(t=0.265，P<0.05)明顯降低，轉錄因子T-bet mRNA表達明顯降低(t=2.400，P<0.05)；Th2類細胞因子IL-4含量明顯升高(t=3.505，P<0.01)，轉錄因子Gata-3 mRNA表達明顯升高(t=2.672，P<0.05)。見圖1。

圖1 胰腺癌組與對照組血清Th1類及Th2類細胞因子與轉錄因子水平比較

2.2 兩組Th17類及Treg類細胞因子與轉錄因子水平比較

與對照組相比，胰腺癌組Th17類細胞因子IL-17含量明顯升高(t=2.798，P<0.05)，轉錄因子RORγt mRNA表達明顯升高(t=2.494，P<0.05)；Treg類細胞因子TGF-β(t=3.317，P<0.01)及IL-10(t=2.754，P<0.05)含量明顯升高，轉錄因子Foxp3 mRNA表達明顯升高(t=4.119，P<0.01)。見圖2。

圖2 胰腺癌組與對照組Th17類及Treg類細胞因子與轉錄因子水平比較

3 討論

腫瘤免疫治療的效果與腫瘤組織內免疫細胞的數量、種類及其分泌的炎癥因子密切相關。已證實胰腺癌組織中存在Th1和Th2兩種亞型的T細胞，且Th1/Th2的比例與胰腺癌患者的預后密切相關[4]。Th2細胞比例較高的胰腺癌組織纖維成分豐富，M2型巨噬細胞增多，腫瘤進展較快，對放療、化療及免疫治療敏感性較差[5-6]。本研究中胰腺癌患者外周血中Th1類細胞因子含量下降，而Th2類細胞因子IL-4含量明顯升高，證實胰腺癌中Th1和Th2細胞因子的平衡發生改變，Th2類細胞因子優勢表達，發生Th1/Th2偏移。T-bet和Gata-3是參與調控Th1和Th2亞群分化的關鍵轉錄因子，本研究結果顯示胰腺癌患者外周血中T-bet mRNA表達降低，Gata-3 mRNA表達明顯升高，但Th1/Th2偏移是否由于其抑制Th1分化或促進Th2分化導致還需進一步研究。

作為CD4+T細胞的第三類亞群細胞，Th17在胰腺癌惡性生物學行為中的作用仍存在爭議。研究表明，Th17細胞及其分泌的IL-17促進胰腺癌的發生發展并誘導腫瘤細胞干細胞化[7-9]；也有研究發現，IL-17可通過募集髓源抑制細胞來抑制胰腺癌的免疫應答[10]。本研究結果表明，胰腺癌患者外周血IL-17含量明顯增加，提示IL-17在胰腺癌的發生發展中起重要作用，拮抗IL-17是否可治療胰腺癌還需要進一步實驗證實。RORγt是Th17細胞誘導分化的特異性轉錄因子，其低表達可限制Th17細胞分化，過表達則會在缺少Th17極化因子的條件下依然誘導IL-17的表達[11]。本研究結果顯示，胰腺癌患者外周血中RORγt mRNA表達水平明顯高于對照組，提示胰腺癌可能有助于CD4+細胞向Th17細胞分化。

作為腫瘤微環境中最主要的免疫抑制性細胞，CD4+CD25+Foxp3+Treg在實體瘤中的生物學效應已越來越明確[12-15]。本研究發現，與對照組相比，胰腺癌組外周血TGF-β和IL-10水平明顯升高，轉錄因子Foxp3表達增加，提示Treg細胞及其分泌的細胞因子可能與胰腺癌的發生及免疫逃逸密切相關。

綜上所述，胰腺癌患者Th1細胞免疫應答下降，Th2、Th17和Tregs類細胞因子優勢表達，提示Th2、Th17和Tregs細胞可能協同加速胰腺腫瘤疾病的發展。有效重塑胰腺癌組織中Th1、Th2、Th17和Tregs的比例及其功能，對于改善胰腺癌免疫治療效果具有重要的意義。