高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定赤芍中沒(méi)食子酸、沒(méi)食子酸丙酯和柚皮素的含量

張海生，王思琦，佘勝楠，周麗紅，丁俞珍，馮春來(lái)

(江蘇大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

赤芍是毛茛科植物芍藥或川赤芍的干燥根，具有清熱涼血，活血祛瘀的功效[1]。其活性成分主要為萜類(lèi)及其苷、鞣質(zhì)類(lèi)、揮發(fā)油、黃酮及其苷等[2-5]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，赤芍具有抗腫瘤、抗氧化、降血脂、抗炎和抗病毒等多種藥理作用[6-10]。研究證實(shí)，赤芍中所含有的柚皮素、沒(méi)食子酸和沒(méi)食子酸丙酯具有抗氧化、抗腫瘤等一系列藥理活性[11-26]。雖然目前已有不同藥材中柚皮素、沒(méi)食子酸和沒(méi)食子酸丙酯的含量測(cè)定方法，但尚未建立同時(shí)檢測(cè)藥材中這三種活性成分的方法。因此，建立一種同時(shí)檢測(cè)赤芍中沒(méi)食子酸、沒(méi)食子酸丙酯和柚皮素含量的檢測(cè)方法對(duì)于赤芍藥效物質(zhì)研究以及藥材質(zhì)量控制具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260型高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司)；InertSustainTMODS-C18色譜柱(上海島津?qū)嶒?yàn)器材有限公司)；XT120A型電子天平(瑞士Precisa公司)。對(duì)照品購(gòu)買(mǎi)自國(guó)藥集團(tuán)，沒(méi)食子酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99%，沒(méi)食子酸丙酯和柚皮素質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，甲醇和乙酸購(gòu)買(mǎi)自國(guó)藥集團(tuán)(色譜純)；赤芍藥材(安徽亳州，經(jīng)江蘇大學(xué)藥學(xué)院歐陽(yáng)臻教授鑒定為毛茛科植物芍藥的干燥根)；超純水；其他試劑均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱(chēng)取20 mg對(duì)照品沒(méi)食子酸、沒(méi)食子酸丙酯和柚皮素，并分別置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，得到質(zhì)量濃度為2 mg/mL的三個(gè)活性成分對(duì)照品溶液。

1.2.2 供試品溶液的制備 精密稱(chēng)取10 g赤芍粉末，置于250 mL圓底燒瓶，按照料液比1 ∶10加入100 mL超純水，40 ℃超聲提取1 h，提取液經(jīng)3 700 r/min離心20 min，取上清液備用[27-29]。

1.2.3 色譜條件 色譜柱為C18色譜柱，流動(dòng)相為甲醇-0.1%乙酸水溶液，體積流量1.0 mL/min，梯度洗脫(0～10 min為90%乙酸水溶液-10%甲醇等度洗脫；10～30 min，由90%乙酸水溶液向50%乙酸水溶液梯度洗脫；30～60 min，50%乙酸水溶液-50%甲醇等度洗脫)，檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量為20 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

分別量取三個(gè)活性成分的對(duì)照品溶液4 mL于玻璃比色皿中，在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外全波長(zhǎng)掃描，如圖1，三個(gè)活性成分在240～280 nm內(nèi)均有良好吸收，沒(méi)食子酸，沒(méi)食子酸丙酯和柚皮素的最大吸收波長(zhǎng)為270 nm，因此確定檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm。

圖1 三個(gè)活性成分紫外全波長(zhǎng)掃描圖

2.2 色譜條件考察

按照“1.2.3”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣，得到?jīng)]食子酸、沒(méi)食子酸丙酯和柚皮素的保留時(shí)間分別為8.6、41.7和54.0 min(圖2)，樣品與對(duì)照品在相同保留時(shí)間有同樣的峰，且三個(gè)樣品分離度良好。

A：樣品；B：混合對(duì)照品

2.3 線(xiàn)性關(guān)系考察

精密吸取“1.2.1”項(xiàng)下三個(gè)活性成分的對(duì)照品溶液，配制三個(gè)成分濃度均為5、20、50、100、150、200和250μg/mL的混合甲醇溶液，按照“1.2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，得到不同成分不同濃度的峰面積，計(jì)算得到三個(gè)活性成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。由圖3可以看出三個(gè)活性成分在5～250 μg/mL的濃度范圍內(nèi)濃度與峰面積成線(xiàn)性正相關(guān)，且R2均>0.999。說(shuō)明方法準(zhǔn)確可靠，線(xiàn)性關(guān)系良好。

圖3 沒(méi)食子酸、沒(méi)食子酸丙酯及柚皮素的含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

2.4 精密度試驗(yàn)

取“1.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，分別取低(5 μg/mL)、中(100 μg/mL)、高(250 μg/mL)三個(gè)濃度進(jìn)行精密度試驗(yàn)。在“1.2.3”項(xiàng)下色譜條件下，每個(gè)活性成分每個(gè)濃度每天測(cè)量5次，計(jì)算日內(nèi)精密度(表1)。同時(shí)每天測(cè)量1次，連續(xù)測(cè)量5 d，計(jì)算日間精密度(表2)。結(jié)果表明，混合三個(gè)活性成分的日內(nèi)精密度和日間精密度的RSD均<2%，說(shuō)明精密度良好，方法準(zhǔn)確可靠。

表1 三個(gè)成分混合物的日內(nèi)精密度結(jié)果

表2 三個(gè)成分混合物的日間精密度結(jié)果

2.5 加樣回收試驗(yàn)

精密配制含有三個(gè)活性成分100 μg/mL混合儲(chǔ)備液備用。分別加入相當(dāng)于原藥物量的80%，100%，120%的對(duì)照品溶液，計(jì)算三個(gè)活性成分的回收率。在“1.2.3”項(xiàng)下色譜條件下進(jìn)樣，計(jì)算得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3，三個(gè)活性成分的回收率均在99%～102%之間，且三個(gè)活性成分回收率的RSD均<2%，說(shuō)明回收率較好，方法準(zhǔn)確可靠。

表3 三個(gè)成分混合物的回收率結(jié)果

2.6 樣品測(cè)定

在“1.2.3”項(xiàng)下色譜條件下，取供試品溶液20 μL進(jìn)行高效液相色譜測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算三個(gè)活性成分的含量，重復(fù)測(cè)量3次。通過(guò)計(jì)算得到三個(gè)成分的含量，其中沒(méi)食子酸的含量最高，沒(méi)食子酸丙酯次之，柚皮素含量最低。由表4可看出每1 g赤芍生藥中沒(méi)食子酸，沒(méi)食子酸丙酯，柚皮素平均含量分別為1.867，0.561，0.093 mg，且含量的RSD分別為0.62%，1.46%，1.08%。

表4 赤芍中三個(gè)活性成分的含量

3 結(jié)論

本研究建立了一種同時(shí)測(cè)定赤芍中沒(méi)食子酸，沒(méi)食子酸丙酯，柚皮素三個(gè)活性成分的高效液相色譜方法，確定檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm，建立了三個(gè)活性成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。該方法簡(jiǎn)單高效同時(shí)測(cè)定三個(gè)活性成分，為其他含有沒(méi)食子酸，沒(méi)食子酸丙酯和柚皮素的中藥的含量測(cè)定與檢測(cè)提供參考。同時(shí)運(yùn)用該方法對(duì)赤芍提取液進(jìn)行了含量測(cè)定，發(fā)現(xiàn)赤芍中沒(méi)食子酸，沒(méi)食子酸丙酯，柚皮素三個(gè)活性成分的含量分別為1.867，0.561，0.093 mg/g，且RSD分別為0.62%，1.46%，1.08%，該方法的建立對(duì)赤芍藥材質(zhì)量控制具有重要意義。