胃癌患者血清miR-7、miR-204表達及其與臨床病理特征、預后的關系

楊建華，郭曉娟，牛廣旭，王靜

(邯鄲市中心醫院，河北邯鄲 056001)

胃癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，2008年全球胃癌新發病例約100萬，胃癌死亡病例約74萬，分別占腫瘤總新發病例數的8%、腫瘤總死亡病例數的10%[1]。目前臨床上，手術切除是胃癌較為有效的治療手段，但近50%患者就診時處于中晚期，患者5年總生存率并不樂觀。研究表明，早期就診胃癌患者的術后5年總生存率可高達90%[2]，因此早期診斷并采取有效治療方案，對改善胃癌患者的預后極其重要，而尋找能夠預測患者預后的生物標志物，也是胃癌研究領域的熱點之一。微小RNA(microRNA)是一類具有調節功能的非編碼RNA，作為一種轉錄后調控因子，microRNA在腫瘤生理病理過程中具有重要的調節功能，如細胞分化、凋亡、增殖和侵襲等[3,4]。研究證實，miR-7在黑色素瘤[5]、結直腸癌[6]、肺癌[7]等多種惡性腫瘤中表達下降，發揮抑癌基因功能；miR-204異常表達與腫瘤細胞增殖、侵襲、化療耐藥相關[8,9]。循環microRNA在血漿中具有較好的穩定性，具有作為無創性診斷、治療、預測預后血清生物標志物的潛能[10]。本研究旨在通過觀察胃癌患者血清miR-7、miR-204表達變化，探討兩者血清水平與患者臨床病理特征、預后的關系，以期為胃癌研究提供依據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2012年1月～2013年12月在我院就診的95例胃癌患者(病例組)。納入標準：術前未接受抗腫瘤治療；術后經病理檢查確診為胃癌；具備完整的病例資料；完成隨訪。排除標準：嚴重肝腎功能不全；全身感染性疾病；免疫系統疾病等。其中男59例，女36例；年齡<60歲48例，≥60歲47例；腫瘤直徑<5 cm者46例，≥5 cm者49例；腫瘤低分化53例，中高分化42例；病理類型:腺癌81例，印戒細胞癌6例，黏液癌8例；有淋巴結轉移56例，無淋巴結轉移39例；TNM分期:Ⅰ～Ⅱ期62例，Ⅲ～Ⅳ期33例。同期選擇體檢健康志愿者95例(對照組)，其中男62例，女33例；年齡<60歲45例，≥60歲50例。兩組年齡、性別等一般資料比較差異無統計學意義。采集病例組患者術前1天、對照組體檢時的晨起空腹外周靜脈血10 mL，室溫靜置10 min，2 000 r/min離心5 min，收集上層血清，置于-80 ℃冰箱保存。本研究經本院倫理委員會審核并通過，所有研究對象簽署知情同意書。

1.2 血清miR-7、miR-204檢測 采用實時熒光定量PCR。采用RNAiso for Small RNA(TaKaRa公司)、氯仿、異丙醇、無水乙醇提取血清總RNA，溶解于焦碳酸二乙酯(Amrsco公司)水中，紫外分光光度計(Eppendorf公司)檢測RNA純度和濃度。采用One Step PrimeScript miRNA cDNA Synthesis Kit(TaKaRa公司)、普通PCR儀(Bio-Rad公司)合成cDNA，反應條件為37 ℃ 60 min、85 ℃ 5 s，將反應產物置于-20 ℃冰箱保存。采用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa公司)、實時熒光定量PCR儀(Roche公司)進行實時熒光定量PCR，反應條件：95 ℃ 30 s，50個循環(95 ℃ 10 s，60 ℃ 60 s)，95 ℃15 s。PCR引物購自上海生工生物工程股份有限公司，序列如下，U6正向引物：5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，反向引物：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′；hsa-miR-7正向引物：5′-CGGCTGGCCCCATCTGGAAGAC-3′，反向引物：5′-CGATGGCTGGCACCATTAGGTAGAC-3′；hsa-miR-204正向引物：5′-GCGGCGGTAGCTTATCAGACTG-3′，反向引物：5′-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3′。以2-ΔΔCT法計算目的基因的相對表達水平，實驗重復3次后進行統計分析。

1.3 隨訪方法 采用電子通訊、門診復查等方式對病例組患者進行隨訪，隨訪時間從術后開始，持續1～60個月，直至患者死亡或者隨訪時間結束。

2 結果

2.1 兩組血清miR-7、miR-204表達比較 病例組、對照組血清miR-7相對表達量分別為0.328±0.116、1.332±0.364，miR-204相對表達量分別為0.376±0.133、1.257±0.324，兩組比較P均<0.05。

2.2 血清miR-7、miR-204表達與胃癌臨床病理特征的關系 胃癌患者血清miR-7表達與淋巴結轉移有關(P<0.05)，與患者年齡、性別、腫瘤直徑、腫瘤分化程度、病理類型、TNM分期無關(P均>0.05)；血清miR-204與腫瘤分化程度、淋巴結轉移、TNM分期有關(P均<0.05)，與患者年齡、性別、腫瘤直徑、病理類型無關(P均>0.05)，見表1。

表1 血清miR-7、miR-204表達與胃癌臨床病理特征的關系

2.3 血清miR-7、miR-204表達與患者預后的關系

2.3.1 血清miR-7、miR-204表達對患者術后5年總生存率的影響 ①血清miR-7相對表達量的中位數為0.345，miR-7低表達組47例、miR-7高表達組48例。miR-7低表達組術后5年總生存率為34.04%、術后中位生存時間為(32.02±3.00)個月，miR-7高表達組分別為58.33%、(47.75±2.58)個月。兩組術后5年總生存率比較差異有統計學意義(Log-rankχ2=8.119，P=0.004)，見圖1。②血清miR-204相對表達量的中位數為0.412，miR-204低表達組48例、miR-204高表達組47例。miR-204低表達組術后5年總生存率為35.42%、術后中位生存時間為(37.38±2.87)個月，miR-204高表達組分別為57.45%、(44.62±2.97)個月。兩組術后5年總生存率比較差異有統計學意義(Log-rankχ2=3.916，P=0.048)，見圖1。

圖1 血清miR-7、miR-204表達對患者術后5年總生存率的影響(Kaplan-Meier生存曲線)

2.3.2 胃癌患者預后的危險因素 Cox回歸模型分析結果顯示，有淋巴結轉移、較高的TNM分期、血清miR-7低表達、血清miR-204低表達是影響胃癌患者預后的危險因素(P均<0.05)，見表2。

表2 胃癌患者預后危險因素的Cox回歸模型多因素分析結果

3 討論

胃癌是一種來源于胃黏膜上皮細胞的惡性腫瘤，其發生發展是一個多因素、多步驟的進行性過程，飲食習慣、壓力、過度疲勞、幽門螺桿菌感染等均是引發胃癌的危險因素[11]。在中國，胃癌死亡病例數約占腫瘤總死亡病例數的25%～35%，已成為一個嚴重威脅人民生命健康的公共健康問題[12]。

microRNA在常見的臨床診斷樣本中可被檢測并定量。血清循環microRNA是一種良好的非侵入性生物標志物[13,14]。miR-7定位于9號染色體，與多種惡性腫瘤關系密切。miR-7可反向調控YY1蛋白表達，有望成為結腸癌YY1癌基因的抑制劑[15]；miR-7通過下調XIAP表達，促進宮頸癌細胞增殖并誘導細胞凋亡[16]；而HOTAIR基因可抑制miR-7表達進而逆轉乳腺癌干細胞EMT過程[17]。本研究中，胃癌患者血清miR-7水平低于健康體檢志愿者，提示miR-7表達降低與胃癌發生相關，miR-7在胃組織中發揮抑癌基因功能，與其在乳腺、結腸組織中功能一致。此外，本研究結果顯示，血清miR-7水平與患者存在淋巴結轉移相關，提示檢測患者血清miR-7水平有利于初步推斷胃癌患者是否發生淋巴結轉移。Xie等[18]的研究結果證實，miR-7可抑制上皮生長因子受體表達進而抑制胃癌細胞侵襲遷移。淋巴結是腫瘤細胞發生侵襲轉移的重要途經，初步推斷miR-7可能與胃癌細胞侵襲遷移過程相關，后續研究將在細胞水平對此科學假說進行驗證。

研究表明，肺癌[9]、急性髓細胞性白血病[19]等惡性腫瘤中均存在miR-204表達異常。Zhang等[20]發現胃癌組織中miR-204表達受抑制。本研究結果也顯示，胃癌患者血清miR-204水平降低，提示miR-204在胃組織中發揮抑癌基因功能。此外，本研究發現血清miR-204水平與腫瘤分化程度、淋巴結轉移、TNM分期有關。Liu等[21]發現，在胃癌細胞中增加miR-204表達可抑制細胞侵襲、EMT等。上述結果提示血清miR-204水平可能與胃癌患者病情進展有關。血清miR-204水平低可能預示較低的腫瘤分化程度、有淋巴結轉移及較高的TNM分期。

有研究證實，外源性增加miR-7能夠增強胃癌細胞的化療敏感性，miR-7低表達可能導致胃癌患者產生化療耐受，導致化療療效低、患者預后差[22]；馬小芬等[23]發現miR-204在胃癌組織中低表達且與其惡性生物學行為相關,上調miR-204可通過下調Bcl-2的表達抑制胃癌細胞的增殖。本研究隨訪結果發現，患者術前血清miR-7、miR-204水平與患者術后5年總生存率有關；Cox回歸模型結果提示，淋巴結轉移、較高的TNM分期、血清miR-7低表達、miR-204低表達均為影響胃癌患者預后的危險因素，可能與miR-7、miR-204低表達促進胃癌淋巴結轉移有關。因此，檢測患者術前血清miR-7、miR-204水平有利于初步預測患者預后，血清miR-7、miR-204有可能作為胃癌患者預后預測的靶分子。

綜上所述，miR-7、miR-204在胃癌患者血清中表達降低，且均與患者較差的臨床病理特征、較低術后5年總生存率有關，血清miR-7低表達、miR-204低表達是影響胃癌患者預后的危險因素，監測患者血清miR-7、miR-204可能有助于評估患者的預后。