納米t-PA基因涂層支架對犬冠狀動脈損傷后血栓形成和再狹窄的影響

李軍，章玲，梁新劍，周陽泱，曾碧媚，蘆愛霞，趙洪磊

(1深圳市人民醫院，廣東深圳518000；2深圳市孫逸仙心血管病醫院)

研究顯示，支架內血栓形成、內膜過度增生是冠狀動脈介入術急性和慢性再狹窄發生的病理生理基礎。攜帶抗栓或抗增殖藥物的新型藥物涂層支架置入冠狀動脈狹窄病變處，通過持續藥物釋放抑制內膜增生和血小板聚集，增加血管正重構，可減少血管再狹窄[1～3]。纖維蛋白誘導并激活組織型纖溶酶原激活物(t-PA)，使纖溶系統激活，從而促進纖維蛋白降解，抗栓效果較強[4,5]，而組織染色發現納米t-PA基因可以獲得支架血管壁和其周圍組織t-PA有效表達[6]。2016年7月～2018年3月,本研究用納米t-PA基因載體涂層支架置入犬冠狀動脈，實現局部血管壁t-PA基因轉染，觀察其對犬冠狀動脈血栓形成和支架再狹窄的影響。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要材料 健康雄性家犬22只，體質量35～40 kg，由深圳大學動物實驗中心提供；質粒pSecTag2B由亞能生物技術(深圳)有限公司保存；感受態細胞E Coli JM109購自Promega公司；CHO細胞系由香港城市大學深圳醫藥與生物研發中心提供；限制性內切酶Hind Ⅲ、KpnⅠ、Bam HI和XhoⅠ購自寶生物工程有限公司；Vent DNA聚合酶和T4 DNA連接酶購自New England Biolabs公司；QIAprep Spin Miniprep Kit、 QIAquick Gel Extraction Kit、QIAgen PCR Product Purification Kit購自QIAGEN公司；DNA marker DL 2000購自上海生工生物有限公司；DMEM、胎牛血清購自GIBCO公司；一抗(兔抗人tPA抗體)、二抗(FITC耦合的羊抗兔IgG抗體)、對照一抗(兔抗β-caterin抗體)由美國Burnham研究所提供。免疫組化檢測試劑一抗(羊抗人t-PA多克隆抗體)、二抗(兔抗羊多克隆抗體)、牛血清白蛋白、t-PA ELISA檢測試劑盒均由晶美生物工程有限公司提供；免疫組化試劑盒系DAKO公司產品。

1.2 白蛋白納米t-PA基因涂層支架制備 首先構建t-PA基因真核高表達質粒，制備載t-PA基因白蛋白納米粒。然后將支架浸泡于白蛋白納米粒液中30 min，晾干后再置入血管基底膜涂層液中30 min，交替操作，使每個支架含有1 mg白蛋白納米t-PA基因質粒涂層。

1.3 犬冠狀動脈內膜損傷支架置入模型建立 22只犬采用5%戊巴比妥靜脈麻醉(25 mg/kg)后，常規手術消毒鋪巾，經皮穿刺股動脈留置6 F鞘管，通過導絲送入直徑3.0 mm球囊導管至冠狀動脈主要分支血管；球囊8～10個大氣壓擴張后，緩慢回撤，重復3次，造成血管內皮夾層形成甚至撕裂。術后動物均不用抗凝治療，立即隨機分為觀察組12只和對照組10只，分別置入載基因支架和裸金屬支架。

1.4 血液t-PA和D-二聚體含量檢測 兩組分別于術前及術后1、2、4、8周取血2 mL，采用Roche E170全自動電化學發光檢測儀檢測t-PA和D-二聚體含量，電化學發光試劑盒由德國羅氏公司提供。

1.5 血管內超聲影像學檢查 兩組術后8周行冠狀動脈造影檢查，觀察血管、支架形態及血管直徑等情況，同時行血管內超聲影像學檢查。使用Boston血管內超聲儀，導管直徑為2.5 F，探頭頻率40 MHz，測量部位為支架內病變，利用導管自動回撤系統共測量3次，計算血管晚期管腔丟失、內膜增生面積、內膜增生容積等指標。

1.6 支架血管病理觀察 8周后處死犬，取出心臟，經冠狀動脈加壓注射4%多聚甲醛適當固定，石蠟包埋切片，病理制片。蘇木素-伊紅染色法染色顯微鏡下觀察局部血管腔內血栓形成、支架內血栓形成和血管壁病理改變，計算血栓形成率。內膜平滑肌細胞及增殖檢測采用標記的鏈菌卵白素-生物素免疫組化法，一抗分別為鼠抗SMC α-actin和PCNA，觀察納米t-PA基因載體涂層支架犬冠狀動脈內膜PCNA陽性細胞分布情況。

2 結果

2.1 兩組手術前后血液t-PA、D-二聚體水平變化 兩組術前血液t-PA、D-二聚體水平比較差異無統計學意義(P均>0.05)；觀察組置入支架后1、2、4、8周t-PA、D-二聚體水平均高于對照組(P均<0.05)。見表1。

表1 兩組手術前后血液t-PA、D-二聚體水平比較

注：與對照組比較，*P<0.05。

2.2 兩組術后冠狀動脈血管內超聲檢查結果 支架置入術后8周對兩組行血管內超聲影像學檢查，顯示觀察組支架管腔丟失、內膜增生面積、內膜增生容積均優于對照組，兩組比較差異均有統計學意義(P均<0.05)。見表2。

2.3 支架血管病理改變和血管壁t-PA表達 肉眼及顯微鏡下觀察，對照組10例血管支架內均可見血栓，血栓形成率100%；觀察組12例中2例可見血栓，血栓形成率16.67%；兩組血管支架內血栓形成率比較有統計學差異(P<0.05)。對照組支架冠狀動脈內膜明顯不規則增厚，內膜中增生細胞不規則，排列紊亂，細胞間基質堆積多，見散在炎性細胞。與對照組比較，觀察組支架冠狀動脈內膜明顯變薄，內膜細胞多為長梭形，PCNA陽性細胞少；PCNA陽性細胞主要分布在增生的血管內膜表面，在血管中膜見散在和較弱陽性信號分布，而血管外膜PCNA陽性細胞染色陰性。

表2 兩組術后冠狀動脈血管內超聲檢查指標比較

注：與對照組比較，*P<0.05。

3 討論

目前，單支架內再狹窄仍是冠心病介入治療技術中難以回避的難題，其發生機制主要有下面幾個方面：①血管彈性回縮。球囊擴張結束后血管在數分鐘內發生急性反應，可造成血管壁的機械性塌陷，導致管腔直徑的丟失。②血栓形成。球囊擴張及支架置入造成對血管壁的損傷，內皮下細胞外基質暴露，導致血小板聚集黏附，凝血酶激活，產生血管內附壁血栓。此外，內皮細胞的損傷還可促進纖溶酶抑制物、血栓素和血小板活化因子的產生，而肝素類物質及纖溶酶激活物合成和分泌減少，也可引起血管局部血栓。③平滑肌過度增生。血管損傷導致平滑肌細胞能從收縮表型轉變為合成表型，復制能力增強，合成功能隨著粗面內質網的增加而增強，參與血管損傷的組織修復。④炎癥反應。球囊擴張及支架置入后血管損傷部位有大量單核巨噬細胞及T淋巴細胞浸潤，并產生多種生長因子、趨化因子、細胞因子，進一步促進白細胞浸潤，引起局部炎癥反應。

從支架內再狹窄機制可以看出，內皮細胞的損傷導致肝素類物質及纖溶酶激活物合成和分泌減少，引起血管局部血栓是重要的再狹窄原因，而納米t-PA基因載體涂層支架的設計充分利用這一特點。T-PA是另一類溶血栓藥物,對血凝塊的作用有相對特異性，通過其氨基末端附近的賴氨酸結合位點與纖維蛋白-纖溶酶原復合物高度親和，而在沒有纖維蛋白時活性相對較低。臨床上已使用重組t-PA有效治療急性心肌梗死和缺血性中風。t-PA的cDNA克隆成功使能夠構建其逆轉錄病毒載體并體外轉導內皮細胞獲得t-PA高表達[7，8]。我們前期實驗室構建了t-PA高表達基因質粒，體外轉染CHO細胞可見t-PA蛋白高表達，并利用超聲微泡技術實現了納米基因載體的靶向兔血管壁轉染，有效地抑制了裸金屬支架術后早期血栓形成和內膜增生[9,10]，基因治療提供了局部t-PA較高的活性并避免了全身出血和血栓反彈[11,12]。

本研究在前期研究的基礎上，對犬冠狀動脈置入納米t-PA基因載體涂層支架的效果行進一步觀察。犬冠狀動脈支架術的模型建立有較高的成功率及可操作性，且犬冠狀動脈內徑與人的冠狀動脈相似[13]，取材方便，成本低，并發癥少，成功率高，本研究中犬在支架置入術后8周研究期間全部存活。結果顯示犬冠狀動脈置入納米t-PA基因載體涂層支架后，內膜不僅無血栓負荷，而且內膜較薄，增生不明顯，考慮這和納米t-PA基因載體抑制了內膜平滑肌增生以及血栓形成有關。t-PA和D-二聚體血液濃度是常規反映血管血栓形成的指標，本結果顯示t-PA和D-二聚體血液濃度在犬冠狀動脈置入支架以后術后可以持續8周的高水平。犬冠狀動脈血管內超聲影像學檢查結果顯示，置入納米t-PA基因載體涂層支架的犬冠狀動脈支架內在支架官腔丟失方面明顯較對照組減少，而內膜增生面積也遠遠小于對照組，這說明納米t-PA基因載體涂層支架也可以有效的防止血管彈性回縮，可以有效保持血管通暢，防止血栓并發癥的發生[14]。

綜上所述，納米t-PA基因載體涂層支架有效預防了支架術后血栓形成，且有效抑制冠狀動脈支架內再狹窄，為新型藥物t-PA基因載體涂層支架臨床應用的提供了動物試驗依據。