植物乳桿菌灌胃對結(jié)腸異常隱窩灶大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)及血清細(xì)胞因子水平的影響

王晨，韓艷，張旖晴

(中國中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院，北京 100102)

大腸癌是臨床常見惡性腫瘤，嚴(yán)重危害人類健康，隨著人們生活方式的轉(zhuǎn)變及診斷水平的不斷改進(jìn)，其檢出率有明顯升高趨勢[1]。大部分大腸癌患者就診時已處于病變中晚期，臨床治療效果差，預(yù)后不良。因此，早發(fā)現(xiàn)、早治療是提高患者生存率、改善預(yù)后的關(guān)鍵。1987年，Bird用實體鏡在大腸癌動物模型中首次發(fā)現(xiàn)異常隱窩灶(ACF)。ACF是目前在光鏡下能發(fā)現(xiàn)的最早期的結(jié)直腸癌癌前病變。ACF主要分布在直腸與左半結(jié)腸，常規(guī)內(nèi)鏡下無法觀察到，需要用亞甲藍(lán)或靛胭脂染色后用普通內(nèi)鏡即可觀察到。研究顯示，結(jié)腸高危腫瘤與ACF數(shù)目密切相關(guān)[2]。腸道菌群一般情況下處于平衡狀態(tài)，如平衡狀態(tài)被打破則發(fā)生腸道菌群失調(diào)，腸道微生態(tài)發(fā)生變化，部分腸道菌群可抑制炎癥及腫瘤發(fā)展，而部分菌群則促進(jìn)炎癥及腫瘤發(fā)展，因此腸道菌群可能參與了大腸癌的發(fā)生發(fā)展。植物乳酸菌(LP)在多種生態(tài)環(huán)境中廣泛分布，定植于哺乳動物的腸道，在腸道中分解為有益的小分子[3]。但LP對腸道菌群及細(xì)胞因子水平的影響，目前研究較少。2018年1月～2019年3月本研究對此作了探討，為大腸癌的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑及儀器 雄性SD大鼠72只，4周齡，體質(zhì)量(130±10)g，購于北京中醫(yī)藥大學(xué)，自由飲食，溫度22～26 ℃，濕度40%～50%。LP由本實驗室培養(yǎng)保存。1，2-二甲基肼(湖北信康醫(yī)藥化工有限公司)，EDTA(美國Ambion公司)，0.2%亞甲藍(lán)(青島捷世康生物科技有限公司)，大鼠腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細(xì)胞介素6(IL-6)、IL-8試劑盒(Abcam公司)，TRIzol提取試劑盒(美國Ambion公司)，cDNA合成試劑盒(碧云天)。離心機(北京白洋淀醫(yī)療器械公司，BY-600A)，熒光定量PCR儀(上海之江生物科技有限公司，EX3600)，光學(xué)倒置顯微鏡(奧林巴斯，CHK)，酶標(biāo)儀(帝肯貿(mào)易有限公司，TECANF50)。

1.2 ACF模型制備及干預(yù) SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2周，將其隨機分為對照組、模型組及干預(yù)組。模型組：于頸背部皮下注射1，2-二甲基肼30 mg/kg，注射后第7天給予PBS灌胃，1次/d，連續(xù)灌胃7 d；灌胃結(jié)束后第7天于頸背部第2次皮下注射1，2-二甲基肼30 mg/kg，第2次注射后第7天再次給予PBS灌胃，1次/d，連續(xù)灌胃7 d；第2次灌胃結(jié)束后第7天，于頸背部第3次皮下注射1，2-二甲基肼30 mg/kg。對照組：于頸背部皮下注射生理鹽水+EDTA溶液，注射后第7天給予PBS灌胃，1次/d，連續(xù)灌胃7 d；灌胃結(jié)束后第7天于頸背部第2次皮下注射生理鹽水+EDTA溶液，第2次注射后第7天再次給予PBS灌胃，1次/d，連續(xù)灌胃7 d；第2次灌胃結(jié)束后第7天，于頸背部第3次皮下注射生理鹽水。干預(yù)組：于頸背部皮下注射1，2-二甲基肼30 mg/kg，第7天給予LP菌懸液1×1010CFU/mL灌胃，1次/d，連續(xù)灌胃7 d；灌胃結(jié)束后第7天于頸背部皮下注射1，2-二甲基肼30 mg/kg，第2次注射后第7天再次給予LP菌懸液1×1010CFU/mL灌胃，1次/d，連續(xù)灌胃7 d；第2次灌胃結(jié)束后第7天，于頸背部皮下第3次注射1，2-二甲基肼30 mg/kg。大鼠正常飲食。觀察各組大鼠一般情況。

1.3 標(biāo)本收集 分別于造模第1、9、18周3組各取8只大鼠，收集大鼠新鮮糞便標(biāo)本，于-80 ℃保存；采集大鼠尾靜脈血；然后用10%水合氯醛(3 mL/kg)麻醉大鼠，切開腹部皮膚，取結(jié)腸(從大鼠盲腸末端至骨盆的肛門)，沿腸長軸切開，用生理鹽水重洗，除內(nèi)容物，將結(jié)腸置于10%中性甲醛溶液中固定24 h。

1.4 ACF形成檢測 取結(jié)腸組織標(biāo)本，用0.2%亞甲藍(lán)染色5 min后置于載玻片，在10倍顯微鏡下觀察ACF形態(tài)結(jié)構(gòu)并記錄其數(shù)目。

1.5 大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)檢測 采用高通量測序技術(shù)。取大鼠糞便200 mg，加入70%乙醇1 mL，10 000 r/min離心3 min，棄上層液體，加PBS，10 000 r/min離心3 min，棄上清液；將離心管于吸水紙上倒置至無液體流出，55 ℃烘箱中放置10 min。用DNA提取試劑盒提取細(xì)菌總DNA，進(jìn)行擴增與純化，步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。高通量測序上機操作，根據(jù)操作分類單元(OTU)分類物種特定導(dǎo)出單個分類水平的樣品進(jìn)行比較，結(jié)果包括樣品中所含的微生物種類。

1.6 血清細(xì)胞因子水平檢測 采用ELISA法。分別于造模第1、9、18周采集大鼠尾靜脈血1 mL，3 000 r/min離心10 min，取上清液，于-80 ℃保存。將血清解凍，按照試劑盒明進(jìn)行操作，將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋，加樣，于37 ℃溫育30 min，洗滌，以上重復(fù)5次；加酶標(biāo)溶液50 μL，于37 ℃溫育1 h，洗板，依次加入顯色劑A、B，避光反應(yīng)15 min(25～37 ℃)，加入終止液50 μL，用酶標(biāo)儀于波長450 nm處讀取光密度值(OD值)。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況比較 造模后第1～9周各組大鼠均對外界刺激敏感，體質(zhì)量增加迅速，對照組、模型組、干預(yù)組體質(zhì)量分別為(497±11)、(455±17)、(472±10)g，但各組體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。造模第10周，模型組大鼠皮毛暗淡無光澤，運動減少，反應(yīng)緩慢，體質(zhì)量降低；造模第20周，部分大鼠肛門變形。干預(yù)組大鼠僅于造模第13周出現(xiàn)精神不振。

2.2 各組大鼠結(jié)腸ACF形成情況比較 對照組大鼠結(jié)腸未見ACF形成。造模第9、18周，與對照組比較，模型組大鼠結(jié)腸ACF多(P均<0.05)；與模型組比較，干預(yù)組大鼠結(jié)腸ACF少(P均<0.05)。見表1。

表1 各組造模后ACF形成情況比較(個，

2.3 各組腸道菌群構(gòu)成比較 模型組厚壁菌門、變形菌門、放線菌門、疣微菌門比例較對照組高(P均<0.05)，擬桿菌門、螺旋菌門比例較模型組低(P均<0.05)。干預(yù)組擬桿菌門、螺旋菌門比例較模型組高(P均<0.05)，厚壁菌門、疣微菌門、放線菌門、變形菌門比例較模型組低(P均<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠腸道菌群構(gòu)成(%)

2.4 各組血清細(xì)胞因子水平比較 對照組造模第1、9、18周血清TNF-α、IL-6、IL-8各時間點比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。模型組、干預(yù)組造模第1周血清TNF-α、IL-6、IL-8水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)；造模第9、18周干預(yù)組血清TNF-α、IL-6、IL-8水平均低于模型組(P均<0.05)。見表3。

表3 各組血清細(xì)胞因子水平比較

3 討論

結(jié)直腸癌是消化道常見惡性腫瘤，其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)居惡性腫瘤第三位，每年新發(fā)病例約占每年確診惡性腫瘤的10%。我國流行病學(xué)研究顯示，每年100萬人中有191人死于結(jié)直腸癌，且其發(fā)病率呈逐年上升趨勢，且發(fā)病年齡趨于年輕化。由于大部分結(jié)直腸癌患者確診時已是中晚期，因此如在臨床能采取有效措施早發(fā)現(xiàn)、早治療是改善患者預(yù)后的關(guān)鍵[4～6]。研究顯示，ACF可作為結(jié)直腸癌的標(biāo)記物，其數(shù)目>5個時可預(yù)測進(jìn)展性腫瘤的發(fā)生[7]。因此了解ACF的特征及其與結(jié)直腸癌的關(guān)系，有重要臨床意義。ACF經(jīng)亞甲藍(lán)染色后鏡下可觀察到。1，2-二甲基肼是致癌劑，可誘導(dǎo)大鼠形成結(jié)直腸癌，ACF為癌前病變，且早于腺瘤出現(xiàn)。本研究采用1，2-二甲基肼成功構(gòu)建ACF大鼠模型。

LP是乳酸菌的一種，屬于革蘭陽性菌，其適宜生長溫度為30～35 ℃，活菌數(shù)比較高，能大量的產(chǎn)酸。LP可通過調(diào)節(jié)腸道微生物群，抑制病原菌；調(diào)節(jié)腸相關(guān)淋巴樣組織及上皮細(xì)胞的免疫應(yīng)答。LP作為人體胃腸道的益生菌群，具有維持腸道內(nèi)菌群平衡、提高機體免疫力和促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)吸收等多種功能。LP在食品工業(yè)中應(yīng)用十分廣泛。由于對食鹽、亞硝酸鹽具有良好的耐受性，對蛋白質(zhì)、脂肪無明顯直接的分解作用等特點，在發(fā)酵肉制品中應(yīng)用很多。同時，也廣泛用于發(fā)酵植物性食品。此外，利用LP還可以生產(chǎn)共軛亞油酸[8～11]。本研究觀察LP對ACF大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)及血清細(xì)胞因子水平的影響。經(jīng)LP干預(yù)后，大鼠于造模第13周才出現(xiàn)精神不振，而模型組大鼠于造模第10周就出現(xiàn)皮毛暗淡無光澤，運動減少，反應(yīng)緩慢，體質(zhì)量降低。且與模型組比較，干預(yù)組大鼠結(jié)腸ACF少。說明LP有效抑制了1，2-二甲基肼的致癌作用。

結(jié)直腸癌的發(fā)病除與遺傳因素有關(guān)外，還有環(huán)境因素。大部分結(jié)直腸癌患者具有相似的飲食與生活習(xí)慣[12]。另外，慢性炎癥也是結(jié)直腸癌的一個重要危險因素。炎癥性腸病的發(fā)生發(fā)展與腸道菌群失調(diào)也有一定關(guān)系。人類胃腸道中大約存在100萬億微生物，大部分為細(xì)菌，其基因組含量超過人類基因組含量的100倍。微生物在人類疾病發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，正常情況下腸道微生物保持動態(tài)平衡，避免病原菌感染，維持健康狀態(tài)。該平衡一旦被打破，可導(dǎo)致各種疾病。微生物可通過多種途徑促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展[13～15]。本研究中，模型組厚壁菌門、變形菌門、放線菌門、疣微菌門比例較對照組高，而擬桿菌門、螺旋菌門比例較模型組低。可見模型組大鼠被誘導(dǎo)形成早期結(jié)直腸癌前病變，大鼠腸道菌群出現(xiàn)紊亂。干預(yù)組擬桿菌門、螺旋菌門比例較模型組高，厚壁菌門、疣微菌門、放線菌門、變形菌門比例較模型組低。說明定植的LP能夠調(diào)節(jié)大鼠的腸道菌群失調(diào)。研究顯示，炎癥及免疫反應(yīng)是結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的危險因素[16]。

促炎因子TNF-α、IL-6、IL-8與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展有一定關(guān)系。結(jié)直腸癌患者血液中TNF-α、IL-6、IL-8水平高于健康人群，在結(jié)直腸癌發(fā)病早期起重要作用。TNF-α可激活STATS、NF-κB途徑，促進(jìn)氧化應(yīng)激介導(dǎo)的DNA損傷，從而誘導(dǎo)癌癥發(fā)生；IL-6通過誘導(dǎo)STATS活化，促進(jìn)iNOS合成，導(dǎo)致DNA損傷，誘導(dǎo)癌癥發(fā)生；腫瘤微環(huán)境中激活的IL-8是腺瘤向腺癌進(jìn)展的調(diào)節(jié)因子[17]。本研究中模型組、干預(yù)組造模第9、18周血清TNF-α、IL-6、IL-8水平逐漸升高，說明腸道存在炎癥反應(yīng)。模型組、干預(yù)組造模第1周血清TNF-α、IL-6、IL-8水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義；造模第9、18周干預(yù)組血清TNF-α、IL-6、IL-8水平均低于模型組。可見，LP可減輕1，2-二甲基肼導(dǎo)致的腸道炎癥。

綜上所述，LP作為益生菌，定植于腸道后減輕1，2-二甲基肼的致癌作用，能夠調(diào)節(jié)大鼠的腸道菌群失調(diào)，減輕腸道炎癥。但本研究并未對LP的具體作用機制進(jìn)行探討，后期將對其進(jìn)行分析研究。