功能化自主裝多肽RADKPS水凝膠對犬椎間盤退變的延緩作用

蘇凌浩 ，裴世深，應金威，徐成，文天佑，阮狄克

(1南方醫(yī)科大學，廣州510000；2中國人民解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學中心)

臨床上對于由腰椎間盤退變而導致的下腰痛主要采取保守治療和手術為主的綜合治療兩種方法。然而，保守治療只能緩解癥狀，并不能阻礙疾病的進一步發(fā)展；手術為主的綜合治療往往是患者最終的結局[1]，但是術后易出現(xiàn)并發(fā)癥以及相鄰節(jié)段的病變[2]。因此，尋求介于保守治療和手術治療之間的治療方案，以期在椎間盤退變初期修復椎間盤，甚至逆轉椎間盤退變形式成為新的研究熱點。研究顯示，生長因子在維持椎間盤內環(huán)境穩(wěn)態(tài)中起重大作用。如BMP-7、BMP-2、TGF-β等能增加椎間盤內水含量，并促進Ⅱ型膠原和蛋白多糖的合成[3]。BMP-7在修復椎間盤損傷的過程中，不但能夠促進Ⅱ型膠原和蛋白多糖的表達，還具有使骨髓間充質干細胞(BMSCs)向受損部位趨化遷移、促使BMSCs向軟骨細胞分化和抑制髓核細胞凋亡的作用，因此非常有希望成為延緩椎間盤退變的種子因子。但與此同時，生長因子進入椎間盤后很快會被椎間盤自身內環(huán)境所代謝，存在時間較短，不能持續(xù)發(fā)揮其有效作用，往往需要多次注射。另一方面，BMP-7具有很強的成骨作用，直接注射到椎間盤體內，會造成一定的成骨風險[4]。本課題組前期將BMP-7的3個活性片段SNVI、KPSS和KAIS通過化學鍵方式結合在新型自組裝納米纖維支架材料RADA16-Ⅰ的C端，形成了3種不同的功能化自組裝多肽。體外實驗發(fā)現(xiàn)載有KPSS片段的RADKPS對人類退變的髓核細胞的生物學效應最強，且作用持續(xù)時間較長，同時成骨能力最弱。為此，本研究制作椎間盤退變模型，對RADKPS水凝膠在活體內對椎間盤的修復作用進行了觀察。

1 材料與方法

1.1 主要材料 1歲齡健康的雜種犬16只(10～15 kg)，雌雄不限，由北京軍事醫(yī)學院動物中心提供。本研究獲得中國人民解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學中心倫理委員會批準。RADA16-Ⅰ、RADKPS多肽粉末各 100 mg(利用固相合成法合成，純度>90%，上海生工生物工程股份有限公司)；胎牛血清(Gibco，美國)；LG-DMEM 培養(yǎng)基(Solarbio，中國)； PBS 緩沖液(Hyclone，美國)；番紅O染色(碧云天生物技術公司)；HE染液(北京索寶生物科技有限公司)；胰酶(Gibco，美國)；聚集蛋白多糖/Ⅱ型膠原ELISA 檢測試劑盒(Blue Gene，中國)；培養(yǎng)瓶(Corning，美國)抗犬聚集蛋白多糖/Ⅱ型膠原一抗(ABCAM，英國)；蛋白定量試劑盒(Thermo公司，美國)。

1.2 犬椎間盤退變模型制作及分組治療干預 16只雜交犬，每只選取L3～4、L4～5、L5～6、L6～7椎間盤進行核磁共振檢測，確保造模前每個腰椎間盤均未退變，均一性良好，參照文獻穿刺制作椎間盤退變模型[5]。待椎間盤造模4周后，通過MRI檢查測定椎間盤髓核區(qū)域以及相對部位腦脊液的灰度值，計算相對灰度值指數(shù)(RGI)，確認造模后椎間盤RGI較造模前明顯下降，且均一良好，保證造模后L3～4、L4～5、L5～6、L6～7椎間盤之間RGI比較無統(tǒng)計學差異。然后，分別用4支不同的微量注射器(27 g)裝載不同的藥物注射椎間盤進行干預治療。L3～4注射不含活性片段的RADA16-I水凝膠40 μL(RADA16-Ⅰ組)，L4～5注射PBS緩沖液40 μL(PBS組)，L5～6注射功能化自組裝多肽RADKPS水凝膠40 μL(RADKPS組)，L6～7注射BMP-7 40 μL(BMP-7組)，L7～S1不做任何處理(正常對照組)。

1.3 椎間盤影像學觀察 在造模前、造模4周、治療12周進行X線檢查，并通過公式算出椎間盤相對高度指數(shù)(DHI%)。DHI=2×(B1+B2+B3)/[(A1+A2+A3)+(C1+C2+C3)]。A1:上位椎體前緣高度；A2:上位椎體中央高度；A3:上位椎體后緣高度；B1:椎間盤前緣高度；B2:椎間盤中央高度；B3:椎間盤后緣高度；C1:下位椎體前緣高度C2；下位椎體中央高度；C3下位椎體后緣高度。DHI%=術后椎間盤DHI/術前椎間盤DHI。在造模前、造模4周及干預治療4、8、12周5個時間點進行MRI檢查，掃描采用 Turbo RARE T2WI序列，掃描主要參數(shù):FOV 60 mm×40 mm, TR/TE4 200 ms/36 ms,層厚1.0 mm,層間距0.5 mm,FA 180°,Matrix 256 ×256,空間最小分辨。MRI成像水平掃描架內徑16 cm,使用心臟線圈率為 234 μm×156 μm/像素，通過影像工作站的Manager軟件測定椎間盤髓核區(qū)域以及相對部位腦脊液的灰度值，計算其RGI。

1.4 椎間盤組織學檢查 在干預治療12周，犬安樂死取出中心的髓核組織。用甲醛固定1周后給予石蠟包埋、切片，分別進行HE染色、Ⅱ型膠原和蛋白多糖免疫組化染色。利用計算機Image plus軟件計算出圖片的累計光密度值，除以染色區(qū)域面積，計算Ⅱ型膠原和蛋白多糖平均光密度值(AOD)。

1.5 椎間盤生化成分定量分析 干預治療12周取出中心的髓核組織，EP管封存后，轉存于-40 ℃冰箱備用，其過程均在無菌狀態(tài)下操作。通過ELISA定量檢測蛋白多糖和Ⅱ型膠原水平。

2 結果

2.1 實驗動物一般情況 16只動物中，1只動物在術中因為麻醉過量而死亡，1只術后出現(xiàn)坐骨神經損傷的表現(xiàn)，但術后2月運動肌力恢復正常；其余實驗動物未發(fā)生明顯手術并發(fā)癥，術后活動正常。死亡動物有樣本補充。

2.2 各組X線檢查椎間盤DHI%變化 與本組造模前比較，治療12周BMP-7組、RADA16-Ⅰ組和PBS組椎間盤DHI%均降低(P均<0.05)，RADKPS組椎間盤DHI%無變化(P>0.05)。相同時間點比較，椎間盤DHI%正常對照組、RADKPS組、BMP-7組、RADA16-Ⅰ組、PBS組依次降低，組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。見表1。

表1 各組不同時間點椎間盤DHI%變化

2.3 各組MRI檢查椎間盤RGI變化 正常對照組各時間點RGI比較無統(tǒng)計學差異(P均>0.05)。治療4、8、12 周3個時間點RGI比較，RADKPS組無統(tǒng)計學差異(P均>0.05)，BMP-7組、RADA16-Ⅰ組、PBS組差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。治療8 、12 周，組間兩兩比較，RGI差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。見表2。

表2 各組不同時間點MRI檢查椎間盤RGI變化

2.4 各組椎間盤組織HE染色情況 正常對照組髓核組織HE染色均一深度紅染，含有大量團簇樣細胞，分布均勻；RADKPS組髓核組織染色較為均一，可見少量團簇樣細胞；BMP-7組、RADA16-Ⅰ組髓核組織團簇樣細胞消失，髓核組織結構紊亂；PBS組髓核組織細胞數(shù)量明顯減少，組織逐漸被膠原所取代。

2.5 各組椎間盤Ⅱ型膠原染色情況 BMP-7組和RADA-16組Ⅱ型膠原蛋白表達均較RADAKPS組明顯降低，每高倍視野陽性細胞平均數(shù)明顯降低，棕色陽性染色細胞數(shù)明顯減少。正常對照組、RADKPS組、BMP-7組、RADA16-Ⅰ組、PBS組Ⅱ型膠原AOD值分別為0.800±0.023、0.653±0.032、0.252±0.023、0.233± 0.013、0.171±0.001，組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。

2.6 各組椎間盤蛋白多糖染色情況 BMP-7組和RADA16-Ⅰ組蛋白多糖表達為弱陽性，RADAKPS組與正常對照組陽性染色明顯。正常對照組、RADKPS組、BMP-7組、RADA16-Ⅰ組、PBS組蛋白多糖AOD值分別為0.860±0.012、0.742±0.014、0.343±0.018、0.321±0.023、0.214±0.016，組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。

2.7 各組椎間盤蛋白多糖和Ⅱ型膠原水平比較 治療12 周，各組椎間盤蛋白多糖、Ⅱ型膠原水平比較差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。見表3。

表3 治療12 周各組Ⅱ型膠原、蛋白多糖水平比較

3 討論

既往研究中，BMP-7之所以能夠對椎間盤損傷產生很好的修復效果取決于其搭載3個活性片段SNVI、KPSS和KAIS。研究發(fā)現(xiàn)，KPSS的修復能力最強，同時成骨能力最弱。因此，KPSS活性短肽可望成為修復椎間盤退變的主要生物因子之一。BMP-7的3個活性片段SNVI、KPSS和KAIS通過化學鍵方式結合在RADA16-Ⅰ的C端，可形成3種不同的功能化自組裝多肽。體外研究發(fā)現(xiàn)，載有KPSS片段的RADKPS對人類退變的髓核細胞的生物學作用最強，且作用持續(xù)時間較長[6]。Li等[7]發(fā)現(xiàn),功能化自組多肽水凝膠RADKPS對凋亡誘導環(huán)境中髓核干細胞具有保護作用，提示其有作為退變椎間盤組織工程材料的潛能。Wu等[8]證實，RADKPS水凝膠既具有BMP-7促進Ⅱ型膠原和蛋白多糖表達的作用，誘導骨髓間充質干細胞BMSCs向受損部位趨化遷移，并向軟骨細胞分化，還能夠持久在椎間盤內表達，減緩BMP-7的成骨風險。既往研究證實,修飾有BMP-7 功能片段的新型功能化自組裝多肽納米纖維水凝膠RADKPS具有良好的細胞相容性、血液相容性及組織相容性[9]。此外RADA16-Ⅰ自身具有很強的機械特性，能夠恢復椎間盤高度，且能夠通過提高椎間盤內水含量從而促進椎間盤的修復。因此,RADKPS水凝膠有望成為椎間盤修復構建組織工程髓核的理想材料之一。

犬椎間盤與人椎間盤形態(tài)上較為相似，大小適中，適合觀察，且犬的脊索細胞自幼年期開始就逐漸減少，適宜作為研究對象。纖維環(huán)穿刺負壓抽吸制作椎間盤退變模型，重復性良好，通過控制不同節(jié)段的負壓強度及持續(xù)時間可以控制椎間盤損傷層度從而制造退變均一的模型。在動物實驗和臨床研究中，沒有癥狀的椎間盤退變主要靠影像學檢查來判斷。早期影像學主要表現(xiàn)為MRI檢查中T2相上髓核組織灰度值減低，退變髓核呈現(xiàn)黑色信號改變；隨著退變的加重，后期X線平片出現(xiàn)椎間盤高度的下降。本研究采取髓核相對灰度值判斷椎間盤影像上信號的變化，比起單純依靠肉眼觀察的Pfirrmann分級定性標準能夠更加準確量化退變的嚴重程度。在本研究中，RADKPS水凝膠組術后椎間盤高度和灰度均得到有效保持，表明髓核含水量得到有效維持，延緩了椎間盤退變進展。治療前后DHI%對比也驗證了RAKPSS水凝膠組椎間盤高度要比造模后其他組保持更良好的狀態(tài)。另一方面，組織學檢測可以從微觀角度評估椎間盤細胞及細胞外基質的變化。髓核組織切片HE染色結果表明，RADKPS水凝膠延緩了髓核細胞丟失的速度，較好地保持了髓核組織形態(tài)結構及細胞外基質。椎間盤細胞外基質主要包括蛋白多糖和Ⅱ型膠原，椎間盤退變時蛋白多糖、Ⅱ型膠原含量降低。本研究免疫組化染色結果顯示，RADKPS組蛋白多糖、Ⅱ型膠原表達深染區(qū)域明顯多于對照組，ELISA定量分析顯示RAKPSS組蛋白多糖、Ⅱ型膠原含量也得到了有效保留。

本研究還存在一些不足之處，如X線的拍攝時間未能做到和MRI同步、未做到大樣本分時間段多次取標本進行生化定量分析、未進行單個運動節(jié)段的生物力學分析、觀察時間短等。因此，RAKPSS水凝膠延緩椎間盤退變的作用尚需要進一步研究。