狼瘡性腎炎患者血清miR-4532、miR-2861表達變化及臨床意義

郭軍利，沈東波，李學剛，張慧濤

(1 珠海市人民醫院 暨南大學附屬珠海醫院，廣東珠海 519000；2 中山大學附屬第五醫院)

狼瘡性腎炎(LN)屬于系統性紅斑狼瘡最為常見的一種并發癥，發病率為60%～80%，可能引起不同程度的腎損傷，病情嚴重時甚至可能引起死亡。該病的治療重點在于早期準確的診斷以及治療，從而避免腎衰竭的發生[1]。當前臨床上主要是通過24 h尿蛋白定量、腎小球濾過率、系統性紅斑狼瘡疾病活動度評分(SLEDAI)以及補體C3、C4水平等指標協助LN的診斷以及評估其活動性。IL-6、IL-18是重要的免疫因子，參與免疫調節及調控炎癥介質。炎癥介質在LN的發生、發展過程可加劇炎癥反應以及增加腎臟功能損傷[2]。miRNA作為非編碼RNA之一，可通過和靶mRNA的3′-UTR以及5′-UTR區堿基互補配對，促使其發生降解或抑制其翻譯，進一步介導炎癥反應的發生、發展過程，參與多種生理以及病理過程，被認為是最為理想的生物標志物，可能成為LN的有效診斷指標[3]。目前，臨床上已有研究報道表明，miR-4532、miR-2861在糖尿病腎病患者的尿液中表達降低，且和腎小球濾過率以及腎間質纖維化密切相關[4]。然而，關于上述兩項指標在LN患者血清中表達的相關研究并不多見。因此，本研究觀察了LN患者血清miR-4532、miR-2861表達變化，并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2015年1月～2018年12月珠海市人民醫院和中山大學附屬第五醫院接受診治的LN患者80例作為研究對象。納入標準：所有研究對象符合美國風濕病學會/歐洲抗風濕病聯盟所制定的LN相關診斷標準[5]，且均接受臨床檢查、影像學檢查以及實驗室檢查等確診為LN；年齡≥18周歲；入院前未接受降尿酸藥物、保腎藥物以及利尿劑等藥物治療。排除標準：入院前7 d內進食高脂高蛋白食物以及大量飲酒等；合并高血壓、糖尿病等基礎疾病者；心、肝、肺等重要臟器發生病變者；交流溝通障礙或伴有精神疾病者。將其根據SLEDAI評分分為活動期組(SLEDAI評分≥10分)42例與穩定期組(SLEDAI評分<10分)38例。其中活動期組男4例、女性38例，年齡22～58(32.32±5.33)歲，體質量指數(BMI)18.33～30.31(24.61±4.66)kg/m2。穩定期組男3例、女35例，年齡22～59(31.36±5.25)歲，BMI 18.29～30.35(24.57±4.62)kg/m2。另取同期珠海市人民醫院接受體檢的健康人員40例作為對照組，其中男5、女35例，年齡21～58(32.39±5.29)歲，BMI 18.24～30.37(24.66±4.65)kg/m2。三組基本資料比較差異無統計學意義，具有可比性。本研究經珠海市人民醫院倫理委員會批準通過，所有研究者知情同意。

1.2 血清miR-4532、miR-2861檢測 采集所有受試者清晨空腹肘靜脈血5 mL，3 000 r/min離心10 min，將獲取的血清保存于-80 ℃冰箱中備用。采用RNA提取純化試劑盒(購自北京天根生化科技有限公司)提取血清總RNA，隨后采用逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)技術檢測各組血清miR-4532、miR-2861。以U6為內參對照，反應程序為94 ℃ 2 min進行1個循環，94 ℃ 40 s、60 ℃ 40 s、72 ℃ 1 min完成35個循環，最后72 ℃、5 min完成1個循環。miR-4532上游引物序列為5′-CCTGGAAAGAATGGAGATGA-3′,下游引物序列為5′-GCACCATCCAAACCACTG-3′。miR-2861上游引物序列為5′-GTCATAGTGCTGGATGGT-3′，下游引物序列為5′-CGGTGGAAGAATACTTATTG-3′。通過2-ΔΔCt法計算miR-4532、miR-2861相對表達量。通過酶聯免疫法檢測血清IL-6、IL-18水平，試劑盒購自上海吉泰依科賽生物科技有限公司。采用貝克曼IMMAGE800特定蛋白分析儀測定C3、C4及24 h尿蛋白定量。采用腎動態顯像法測定腎小球濾過率。

2 結果

2.1 各組血清miR-4532、miR-2861表達比較 活動期組、穩定期組血清miR-4532、miR-2861表達均較對照組低(P均<0.05)，且活動期組較穩定期組低(P均<0.05)，見表1。活動期組、穩定期組腎小球濾過率、補體C3、C4水平均較對照組低(P均<0.05)，且活動期組較穩定期組低(P均<0.05)，見表1。活動期組、穩定期組血清IL-6、IL-18、24 h尿蛋白定量水平較對照組高(P均<0.05)，且活動期組較穩定期組高(P均<0.05)，見表1。

表1 各組血清miR-4532、miR-2861表達及相關實驗室指標比較

注：與對照組相比，#P<0.05；與穩定期組相比，*P<0.05。

2.2 LN患者血清miR-4532、miR-2861表達與各實驗室指標的相關性 LN活動期組患者血清miR-4532、miR-2861表達與血清IL-6、IL-18、24 h尿蛋白定量以及SLEDAI評分均呈負相關，而與腎小球濾過率呈正相關(P均<0.05)，見表2；而穩定期組患者血清miR-4532、miR-2861表達與各實驗室指標無相關性。

表2 LN活動期組患者血清miR-4532、miR-2861表達與各實驗室指標的相關性

2.3 血清miR-4532、miR-2861診斷LN的價值 經ROC曲線分析可得：血清miR-4532診斷LN的ROC曲線下面積為0.732(95%CI：0.651～0.834)，最佳閾值為7.58，敏感度為81.14%，特異度為64.23%；而miR-2861診斷LN的ROC曲線下面積為0.741(95%CI：0.623～0.802)，最佳閾值為8.90，敏感度為78.35%，特異度為66.82%。

3 討論

LN是指系統性紅斑狼瘡并發雙腎功能顯著受損的一種免疫性疾病，患者主要臨床表現囊括蛋白尿、腎功能下降以及血尿等，其發病可能和免疫細胞、細胞因子以及免疫復合物形成等多種免疫異常密切相關[5]。已有研究[6]表明，Th1/Th2細胞因子平衡失調在體內許多自身免疫性疾病包括系統性紅斑狼瘡中發揮重要且關鍵的作用。IL-18和IL-6作為Th1和Th2重要的細胞因子，在診斷LN以及評估疾病的活動性方面發揮著重要的作用[7]。相比正常人以及穩定期患者，活動期LN患者IL-18和IL-6明顯升高。然而，機體自身炎癥以及免疫狀態容易影響IL-18和IL-6的水平，蛋白尿和補體C3、C4的水平也容易受到其他因素的影響[8]。因此上述實驗室指標診斷LN的特異性較差，臨床應用存在一定的局限性。

miRNA是一類長21～25 nt的單鏈小分子RNA，來源于染色體的非編碼區，具有高度保守性，能夠在轉錄后水平上對基因的表達進行負調控，主要參與調控人體30%左右的基因表達，作用涉及到生長發育和細胞增殖、分化、凋亡等多種生物學過程。腎臟中也會特異地缺失或者低表達某些特異miRNA，能夠通過調控靶基因，產生調節腎臟功能的特異性蛋白，介導腎臟疾病的發生和發展[9]。且近年來研究[10,11]證實，miRNA可能通過調控機體的淋巴細胞功能以及免疫細胞反應活性，繼而參與LN的發生、發展過程。而miR-4532、miR-2861是近年新發現的具有調控機體淋巴細胞功能以及免疫細胞反應活性的miRNA。目前，臨床上有學者認為遺傳、性激素、環境、病毒感染以及藥物等多因素共同作用是LN的發病機制[12]。而隨著相關研究的不斷深入，不少學者發現LN的發病可能和淋巴細胞功能異常以及細胞因子的異常表達密切相關，且炎癥可能在LN的發病過程中起著至關重要的作用[13]。miR-4532、miR-2861能否通過調控炎癥因子的表達活性影響疾病的活動性，值得臨床深入探討和研究。

本研究結果發現，LN活動期組血清miR-4532、miR-2861較對照組和LN穩定期組低，且活動期組IL-6、IL-18、24 h尿蛋白定量水平較高，腎小球濾過率及補體C3、C4水平較低，提示血清miR-4532、miR-2861表達可能與LN患者的活動性有關，且活動期LN患者臨床腎功能低下，反映活動性的指標升高。此外，本研究還發現，LN活動期組血清miR-4532、miR-2861表達與血清IL-6、IL-18水平均呈負相關關系。提示LN活動期患者的血清miR-4532、miR-2861表達下調可能對其腎損傷程度以及機體炎癥水平發揮負調控作用。分析原因，IL-6主要是由T淋巴細胞以及B淋巴細胞等細胞分泌而來的細胞因子，參與了多種自身免疫性疾病的發生、發展過程，其表達異常增高極易引起機體免疫調節的紊亂，從而在LN的發病中起著至關重要的作用。IL-18屬于促炎癥細胞因子之一，可通過和內皮細胞表面的蛋白多糖相結合，同時促進白細胞和內皮及內皮下基質相結合，從而促進白細胞的滲出游走，進一步促進炎癥的發生，繼而增加LN的發生風險[14]。杲和艷等[13]研究同樣表明，miR-4532、miR-2861表達與LN的活動性和炎癥水平相關。由此可見，miR-4532、miR-2861表達升高可以通過調控降低IL-6和IL-18水平，在減輕腎臟炎癥和損傷方面起到重要的保護作用。

腎小球濾過率主要是指腎臟于單位時間內所生成的超濾液量，在腎功能評估中價值較高[15]。有研究[16,17]發現，糖尿病腎病患者血清miR-4532、miR-2861表達降低與腎小球濾過率、腎間質纖維化/腎小管萎縮存在一定相關性。另有研究學者[18]提出，LN患者miRNA表達的異常可能與毛細血管內皮細胞炎癥具有相關性。本研究發現，LN活動期組血清miR-4532、miR-2861表達與腎小球濾過率呈正相關。推測當血清miR-4532、miR-2861表達降低時，對下游相關的炎癥介質如IL-6和IL-18調控能力減弱，血清IL-6和IL-18的表達水平升高，激活血管內皮炎癥活動，進而介導炎癥損傷以及腎臟纖維化，最終導致腎功能下降和腎小球濾過率降低。此外，血清miR-4532、miR-2861表達與24 h尿蛋白定量、SLEDAI評分呈負相關，24 h尿蛋白定量、SLEDAI評分作為反映LN患者活動性的指標，上述結果提示血清miR-4532、miR-2861表達降低在介導炎癥損傷和腎臟纖維化的同時，還可以對腎小球濾過膜造成損傷，導致蛋白尿的產生和疾病的活動性增加。

本研究ROC曲線分析發現，血清miR-4532、miR-2861對LN的診斷效能均高。由于LN屬于自身免疫介導的,以免疫性炎癥為突出表現的疾病。而miR-4532、miR-2861能夠通過炎癥介質IL-6和IL-18參與機體內皮細胞炎癥的調節，因此在LN的診斷和活動性評估方面具有重要的作用，可以作為LN的早期診斷和活動性評估的生物學標志物。

綜上所述，miR-4532、miR-2861在LN患者血清中表達降低，其表達下降可以反映LN患者的炎癥反應和疾病的活動性，亦可以反映腎功能損傷情況，對LN臨床診斷和病情評估具有重要的應用價值。