原煙發酵過程化學成分的變化規律

葉建斌 王璐 楊峰 張展 楊宗燦 劉向真 楊雪鵬 王根發

摘要：為闡明打葉復烤工藝對煙葉自然發酵的影響，考察室溫條件下原煙與片煙發酵過程中的化學成分變化規律差異。收集6個不同地區的初烤后原煙，同時對這6種煙葉進行模擬打葉復烤制成片煙，將原煙及片煙同時放置在室溫下自然發酵60 d，定期取樣并檢測常規化學成分（水溶性總糖、還原糖、淀粉、煙堿及總氮）含量。結果表明：隨著發酵進行，原煙中淀粉、水溶性總糖含量均有所減少，還原糖含量稍有增加，總氮含量呈下降趨勢;而片煙中淀粉、總糖及還原糖含量變化均不明顯，但總氮含量略有下降;統計分析顯示，原煙和片煙在發酵60 d后上述4種化學成分的變化量均存在差異性（0.01

關鍵詞：原煙;片煙;發酵;化學成分;變化規律;打葉復烤

中圖分類號： S572.9?文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）20-0212-06

煙葉發酵可有效改善煙葉品質[1]。朱大恒等分析了烤煙發酵過程品質及香吃味的形成特點，強調了發酵過程煙葉內部化學成分轉變是煙葉吸食品質形成的重要因素[2]。因此，研究煙葉發酵過程中的化學成分變化規律對于控制煙葉內在品質具有重要的意義。目前，一般將煙葉發酵分為人工發酵和自然發酵。

有部分研究探討了人工發酵過程中煙葉內在化學成分含量的變化規律。閆克玉等研究了河南烤煙人工發酵過程的化學含量變化規律，結果表明，發酵過程中水溶性總糖、總氮、總植物堿、總揮發堿和石油醚提取物含量均有所減少，但總揮發酸含量則有所增加[3]。李曉等通過添加蛋白酶、淀粉酶并控制溫濕度，考察了人工發酵對煙葉蛋白質降解及還原糖含量變化的影響，證明了添加酶發酵煙葉的可行性[4]。趙銘欽等通過添加煙葉發酵增質劑，可促進煙葉內部有機物質的分解及轉化，有效改善了煙葉品質[5]。

與人工發酵相比，自然發酵對于改善煙葉品質具有更好的效果[2]。大量研究證實，烤煙在自然陳化（醇化）過程中，化學成分含量發生了不同程度的轉變。郭俊成等研究了皖南烤煙陳化過程的理化性質含量變化規律，陳化過程煙葉總糖、煙堿、總氮含量都有不同程度的降低，陳化時間以不超過3年為宜[6]。周碧波等研究了不同產地片煙醇化過程中化學成分含量的變化情況，結果表明，總糖含量有所下降，揮發酸含量呈逐步上升的趨勢，部分產地煙堿含量有下降的趨勢，同時證實這些煙堿可轉化分解生成水溶性吡啶衍生物、氧化煙堿和煙酸[7]。劉東洋對烤煙陳化過程中的生化指標進行詳細研究，發現淀粉、可溶性蛋白、游離氨基酸、葉綠素含量均有所下降，石油醚提取物及類胡蘿卜素含量呈先降后升的趨勢[8]。

2種發酵的本質是相同的，都是在適宜的溫濕度下利用煙葉表面或內部微生物及生化酶促進內含物的轉化，從而改善煙葉品質，是一種煙葉的初加工方式[1]。因此，控制合適的溫濕度或存儲條件，可以在醇化過程中間接實現煙葉的人工發酵。如宋紀真等研究了不同貯存條件對片煙醇化的影響，結果顯示，在溫度較高、相對濕度適宜的環境下貯存的片煙外觀質量較好，更有利于片煙吸味品質的改善[9]。鄧賓玲等研究證明，片煙在溫度和相對濕度適宜的環境下存放相應的時間后，香氣質、香氣量明顯改善，雜氣、刺激性明顯減輕，余味、濃度適中[10]。不同發酵條件下，煙葉內含物變化差異的主要原因是其表面或內部的生物活性有所不同[11]。趙銘欽等研究了烤煙陳化期間的生物活性變化情況，證明微生物或酶的活性會隨著陳化過程而有所降低，并認為煙葉葉面活性是煙葉自然發酵的“催化劑”[12-13]。

然而，上述研究多集中在對打葉復烤后片煙自然陳化過程的研究，關于打葉復烤前原煙的自然發酵導致的化學成分含量變化規律未有相關的報道。劉東洋的研究證實，原煙表面微生物經打葉復烤后數量和種類均有所減少[8]。筆者所在課題組在前期研究中也證實，一些降解大分子或產香相關的微生物在經過打葉復烤后明顯減少，并影響后期的煙葉人工發酵過程[14]。本研究收集不同地區的初烤后原煙，在不控制溫濕度條件下，進一步考察原煙短期自然發酵過程的化學成分變化規律。結合實際生產過程，對原煙進行60 d發酵考察，并與復烤后的片煙進行平行對比，探索原煙內在化學物質隨發酵時間點的變化而變化的情況。研究結果對于煙葉質量控制及開發煙葉發酵工藝具有一定的理論指導意義。

1?材料與方法

1.1?試驗材料與儀器

供試煙葉來自6個不同產地，分別為重慶C3F、洛陽C3F、云南C3F、南陽C3F、廣西C3F、貴州C3F，全部為初烤后的原煙，試驗前保存于4 ℃冰箱內。

主要儀器：AA3-連續流動分析儀，購自德國布朗盧比公司;Agilent 7820A氣相色譜儀，購自美國Agilent公司;KL512J數控恒溫水浴鍋，購自上海鴻經生物儀器制造有限公司;BSA2202S千分位精確天平，購自賽多利斯（Sartorius）科學儀器（北京） 有限公司。其他儀器參考YC/T 159—2002《煙草及煙草制品?水溶性糖的測定?連續流動法》[15]、YC/T 216—2007《煙草及煙草制品?淀粉的測定?連續流動法》[16]、YC/T 161—2002《煙草及煙草制品?總氮的測定?連續流動法》[17]、YC/T 246—2008《煙草及煙草制品煙堿的測定氣相色譜法》[18]準備。

1.2?試驗方法

1.2.1?取樣方法

每種樣品原煙平均分成 2個部分：一部分直接進入倉庫儲存 （自然狀態下的原煙）;另一部分經過 70 ℃ 高溫處理15 min后，采用模擬復烤方式去梗后打成片煙，然后進入倉庫儲存 （打葉復烤后片煙）。

以放置時間作為起始發酵時間。從發酵后0 d開始，7、14、21、28、35、45、52、60 d各取1次樣，每次取樣2 kg左右，將每次取得的樣品放入冷庫中存放，以保持取樣時的狀態，最后統一進行檢測。

1.2.2?檢測方法

煙樣中的水溶性總糖和還原糖含量參照YC/T 159—2002《煙草及煙草制品?水溶性糖的測定?連續流動法》[15]進行測定;煙樣中的淀粉含量參照YC/T 216—2007《煙草及煙草制品?淀粉的測定?連續流動法》[16]進行測定;煙樣中的總氮含量參照YC/T 161—2002《煙草及煙草制品?總氮的測定?連續流動法》[17]進行測定;煙樣中的煙堿含量參照YC/T 246—2008《煙草及煙草制品煙堿的測定氣相色譜法》[18]進行測定。每個項目均重復檢測3次，并計算平均值和標準差。

1.3?數據處理與分析

每個項目均重復檢測3次，并采用SPSS 19.0軟件計算平均值和標準差，對原煙及片煙的各化學成分含量的最終變化情況進行相應的顯著性差異分析，計算P值，P≥0.05時認為無差異性，P<0.05時認為差異顯著，P<0.01認為差異極顯著。

2?結果與分析

2.1?發酵過程中煙葉淀粉含量的變化

由圖1可知，不同地區煙葉的淀粉含量有一定的差別，其中云南煙葉所含的淀粉含量最高，為4.39%（原煙）和4.21%（片煙），廣西所含的最低，為2.55%（原煙）和2.35%（片煙）。同一地區煙葉中，原煙中所含的淀粉含量高于片煙，這可能與打葉復烤過程淀粉降解有一定的關聯。楊波等的研究[19]也證明了這一點，淀粉含量的減少是由回潮和潤葉的高溫高濕環境使淀粉向糖類化合物的轉化導致的。

在60 d的發酵過程中，6個地區的原煙中淀粉含量均隨著發酵的進行發生明顯的下降，而復烤后的片煙則下降不明顯。如云南原煙中淀粉含量從4.39%（0 d）降到3.74%（60 d），而片煙中則從4.21%（0 d）降到4.03%（60 d），兩者的降解率存在統計學意義上的差異性（P=0.02<0.05），其他地區也呈現類似結果（圖1）。發酵過程中，原煙和片煙中淀粉降解率的差異，有可能是由于原煙表面的可以降解淀粉的微生物數量及種類多于片煙，或煙葉內部淀粉降解酶的活性高于片煙。進一步分析6個不同地區的原煙，發現在發酵0～45 d之間淀粉含量快速下降，而45～60 d下降較慢，如廣西的原煙在前45 d淀粉含量由2.55%降到2.09%?而45 d后則降解到了2.01%。不同地區原煙中淀粉降解率有所不同，其中重慶為24.91%，南陽為23.59%，洛陽為28.94%，廣西為21.18%，云南為14.81%，貴州為17.51%。

2.2?發酵過程中煙葉總糖含量的變化

由圖2可知，同一地區煙葉中，片煙的總糖含量略高于原煙，但差異不顯著（對6個地區煙葉分析顯示均為P>0.05）。隨著發酵的進行，片煙中總糖含量基本維持不變，但原煙則下降較為明顯。不同地區原煙總糖含量均出現明顯減少，如重慶減少21.93%，南陽減少38.50%，洛陽減少29.21%，廣西減少31.59%，云南減少20.01%，貴州減少22.62%。前期的研究顯示，原煙表面微生物比復烤后片煙豐富，且數量要多[14]，因此，總糖含量的減少可能與微生物的代謝活性有一定的關系。在發酵過程中，原煙總糖含量的下降主要發生在前45 d，如重慶原煙從起始的17.65%降到13.82%，而在 45 d 后基本維持穩定，其他地區原煙表現出相同的發酵結果。

2.3?發酵過程中煙葉還原糖含量的變化

由圖3可知，發酵起始階段，原煙中的還原糖含量要低于片煙。有文獻報道，打葉復烤可以使部分大分子多糖降解為小分子還原糖，從而引起還原糖含量的增加，如淀粉降解導致的還原糖含量增加[20]。在60 d的發酵過程中，原煙中的還原糖含量均表現出少量增加，如重慶原煙還原糖含量增加13.61%，南陽增加13.76%，洛陽增加13.35%，廣西增加12.36%，云南增加14.52%，貴州增加12.88%。在煙葉發酵過程中，還原糖的變化有兩面性，部分還原糖可能還會被微生物消耗掉，因此其增加量有限。原煙在發酵60 d的過程中，還原糖的有限增加證明了其降解大分子生成的還原糖量要稍高于其消耗的量。相反，片煙中還原糖含量則較為穩定，發酵60 d的過程中基本維持不變。已有文獻報道顯示，片煙醇化半年后，還原糖含量有一定的減少[21]。郝廷亮等的研究表明，隨著片煙自然陳化時間延長，總糖、還原糖、煙堿和總氮含量都是逐步降低的[22]。在本研究中，片煙中還原糖含量維持穩定與發酵時間短有一定的關系。

2.4?發酵過程中煙葉煙堿含量的變化

煙堿含量是決定煙葉品質的重要化學成分之一，本研究對發酵過程的煙堿變化情況進行了分析。圖4顯示，在初始階段，6個不同地區的原煙煙堿量均高于片煙，差異量在 1%～6%之間。由于打葉復烤過程工藝需要高溫高濕條件[19]，因此可能會造成部分游離煙堿的散失，這也是導致煙葉煙堿含量經打葉復烤后顯著下降的主要因素之一，這與袁逢春等的研究結果“打葉復烤后煙葉總糖含量、糖氮比及糖堿比升高，總氮、煙堿和鉀含量降低”相似[20]。隨著發酵的進行，原煙和片煙中煙堿均緩慢下降，且下降趨勢一致（圖4）。片煙和原煙的煙堿降解率差異較小（統計分析顯示，6種不同地區煙葉間原煙與片煙降解率差異P值均>0.05，即P重慶=0.43，P南陽=0.27，P洛陽=0.37，P廣西=0.28，P云南=0.19，P貴州=0.48）。發酵過程中煙堿含量的減少可能與部分煙堿降解菌有關，也與部分游離煙堿揮發相關。

2.5?發酵過程中煙葉總氮含量的變化

由圖5可知，不同地區煙葉發酵過程中，原煙總氮含量降低趨勢明顯，而片煙中總氮含量稍有下降，其下降主要表現在前30 d左右。經60 d的發酵后，不同地區的原煙總氮降解率存在一定的差異，重慶為26.01%，南陽為20.83%，洛陽為26.58%，廣西為20.97%，云南為20.31%，貴州為17.30%。不同地區片煙總氮降解率則差異較小：重慶為6.75%，南陽為6.90%，洛陽為10.27%，廣西為5.68%，云南為7.57%，貴州為7.01%。煙葉中氮類化合物主要包括蛋白質、煙堿及氨基酸。游離煙堿的揮發可能是導致總氮減少的主要原因之一。原煙比片煙總氮減少更多的原因可能是部分蛋白質降解，或氨基酸類化合物被微生物內源消耗后成為游離的揮發性氮化合物。在發酵過程中，原煙總氮含量的變化同樣表現出 “前45 d 較快，后15 d速度減緩”的趨勢。

3?結論與討論

在前期的研究中，原煙表面微生物經打葉復烤后發生明顯變化，且會影響煙葉人工發酵過程[14]。經過1個月的恒溫恒濕發酵后，原煙中的淀粉、蛋白質、總氮等含量明顯減少，還原糖含量增加?煙堿含量也有一定的減少。由于在實際生產中，原煙存放一般在自然狀態下放置，并直接由復烤廠進行打葉復烤，此過程中煙葉化學成分含量變化規律尚未有相關研究。因此，本研究對6個地區的原煙與其模擬打葉復烤后的片煙進行自然發酵對比，以進一步分析打葉復烤工藝對煙葉化學質量的影響，同時進一步驗證原煙表面微生物可以通過發酵對煙葉內在質量產生影響。

本研究結果顯示，自然發酵過程中原煙的化學成分含量的變化比片煙要劇烈，如淀粉、水溶性總糖含量均有明顯減少，但片煙中則無明顯變化。另外，6個地區的原煙中蛋白質、總氮含量均呈下降趨勢，而片煙中總氮含量雖略有下降，但趨勢不明顯。值得注意的是，在發酵過程中，2種煙葉的煙堿含量均有不同程度地降低，但變化差異較小，這證明煙葉在自然發酵過程中，煙堿主要與環境有關，游離煙堿的揮發是導致其降解的主要原因。原煙在60 d的自然發酵過程中，前 45 d 化學成分含量變化較為劇烈，后15 d各化學成分含量漸趨于穩定，這可能與原煙表面微生物在自然發酵過程中逐漸趨于穩定或進入休眠狀態有一定的關聯，與之前的研究[12]有類似的結論。本研究結果證實復烤工藝是影響煙葉自然發酵的一個關鍵因素。

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