干擾素刺激基因15在人類免疫缺陷病毒感染中作用的研究進展

吳還梅，盧洪洲,2,3

1. 復旦大學附屬公共衛生臨床中心感染科， 上海 201508； 2. 復旦大學附屬華山醫院感染科， 上海 200040； 3. 復旦大學上海醫學院內科學系， 上海 200032

人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)的發現距今已超過35年，其感染引發的獲得性免疫缺陷綜合征(acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)是導致感染者死亡的主要原因。根據聯合國艾滋病規劃署2018年最新報道，截至2017年，全球約有3 690萬HIV感染者，其中2017年新發感染180萬。總計約有 2 170 萬HIV感染者接受規范化聯合抗反轉錄病毒療法(combination antiretroviral therapy，cART)。自2000年以來，新發HIV感染人數及AIDS相關死亡人數逐年下降[1]，這無疑得益于有效的cART，但同時也與生存期延長的HIV慢性感染者所占比例上升有關，即宿主免疫系統與HIV復制之間的博弈日趨平衡。眾所周知，目前國內常用cART治療方案的用藥劑量相對較大，患者服用后往往伴隨嚴重的藥物毒副反應，如肝腎損傷。因此，在探索抗HIV藥物減量及多藥合一方案的同時，研究人員仍致力于揭示宿主自身免疫對抗機制及篩選胞內抗病毒因子，以期能通過調動機體自身免疫應答，配合減量的cART治療，從而提高患者生存質量，實現HIV感染的功能性治愈。

干擾素(interferon，IFN)是一種具有廣譜抗病毒作用的宿主因子。它作用于相鄰細胞表面的干擾素受體(interferon receptor，IFNR)，激活Janus激酶/信號轉導和轉錄激活因子(Janus kinase/signal transducer and activator of transcription，JAK/STAT)信號通路，誘導數百種干擾素刺激基因(interferon-stimulated gene，ISG)的表達，包括干擾素調節因子(interferon regulatory factor，IRF)、蛋白激酶R(protein kinase RNA-activated，PKR)、γ干擾素誘導蛋白10(interferon γ-inducible protein 10，IP10)、2′，5′寡聚腺苷酸合成酶(2′，5′-oligoadenylate synthetase，OAS)、類泛素蛋白ISG15等，介導了宿主自身抑制HIV復制的過程。其中，ISG15為IFN刺激后上調表達最顯著的胞內宿主因子之一，與其共同表達的還有ISG15共價結合靶蛋白所需的連接酶復合體[2]。一直以來，ISG15的抗病毒作用備受關注，近期研究更提出ISG15具有免疫調節功能。

1 ISG15的生物學特征及表達情況

isg15編碼的泛素樣蛋白分子ISG15又稱為泛素交叉反應蛋白(ubiquitin cross-reactive protein，UCRP)，是第1個被鑒定的類泛素修飾蛋白。成熟的ISG15相對分子質量為 15 000，由相對分子質量為 17 000 的前體蛋白水解去掉C端的8個氨基酸和N端的蛋氨酸而來。C端和N端為兩個泛素樣結構域，分別與泛素有29%和31%的同源性[3]。與廣泛存在于各種真核生物中的泛素及其他類泛素分子不同，ISG15只在脊椎動物中表達，包括人類、猴和小鼠，且在不同物種間遺傳學差異較大。

ISG15在胞內外以游離蛋白分子形式存在，能誘導天然殺傷(natural killer，NK)細胞和T細胞產生IFN-γ[4]，但機制尚不明確。單核細胞、T細胞、B細胞、樹突細胞(dendritic cell，DC)、NK細胞和粒細胞在未經IFN刺激的情況下能表達ISG15[5]，提示ISG15在正常生理條件下發揮一定的作用，可能抑制自身免疫的發生和機體的過度活化。上皮細胞來源的細胞系及健康人外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)經IFN-β刺激24 h后，胞內及培養上清液中均能檢測到ISG15蛋白，且胞內表達量顯著高于胞外[6]。人肺癌細胞系A549經IFN-β刺激后也能顯著上調ISG15表達[7]。

原代淋巴細胞和單核細胞經IFN-α或IFN-β刺激后能上調ISG15的表達，單核細胞系THP-1在同樣刺激下可將游離的ISG15緩慢分泌到培養基中[8]。在cART療效良好的HIV合并丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染的患者中，漿細胞樣樹突細胞(plasmacytoid dendritic cell，pDC)中也能檢測到上調表達的ISG15[9]。病毒感染時，ISG15的上調表達依賴IRF。其中，IRF3為IFN信號通路的關鍵因子，其編碼的蛋白能結合到含有干擾素刺激應答元件(interferon-stimulated response element，IRSE)的ISG15啟動子區，上調ISG15表達[10]。此外，淋巴細胞特異性轉錄因子PU.1能與IRF4或IRF8形成異源復合體，激活ISG15轉錄[11]。

中性粒細胞為血液循環系統中豐度最高的細胞亞群，是機體抵抗感染的第1道防線。研究人員從約氏瘧原蟲感染的小鼠紅細胞裂解液中分離到ISG15蛋白，并證明其具有顯著的中性粒細胞趨化作用[12]，提示ISG15可能在中性粒細胞介導的炎性反應中發揮一定作用。此外，Poly (I∶C)、脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)或IFN-β刺激中性粒細胞后，ISG15的表達也顯著上調[13]。研究人員發現，中性粒細胞中可觀察到ISG15與明膠酶和分泌顆粒的共定位，提示ISG15在粒細胞中通過分泌途徑表達[5]。由此可見，IFN應答通路廣泛存在于各亞群細胞，不管在胞外還是胞質中均能檢測到游離的ISG15蛋白，只是表達量有較大差異。

2 ISG15的抗病毒作用

病毒感染能顯著上調ISG15表達，不同細胞亞群對IFN刺激的響應性也存在差異。已有的報道顯示，ISG15具有抗流感病毒、Sindbis病毒、皰疹病毒、HIV和埃博拉病毒的作用[14-16]。研究人員在ISG15基因敲除小鼠模型中發現，ISG15缺失導致小鼠對流感病毒A和B亞型、單純皰疹病毒1型[17]及仙臺病毒[15,17-18]的易感性增加，從而證明了ISG15的抗病毒作用。

2.1 ISG15與靶蛋白的共價結合

分泌到胞外的ISG15能與靶蛋白共價結合，發揮類泛素化修飾功能，稱為ISG化(ISGylation)。這些靶蛋白包括IFN誘導的抗病毒因子，如PKR、GTP酶MxA、HuP家族、維甲酸誘導基因Ⅰ (retinoic acid-inducible gene Ⅰ，RIG-Ⅰ)等，以及介導RNA剪切、染色體重建、聚合酶轉錄、細胞骨架構建等功能的蛋白分子[19]。近期有研究顯示，ISG15的E3泛素蛋白連接酶HERC5催化ISG15與IRF3共價結合，減弱IRF3與其負調節因子Pin1的相互作用，從而導致IRF3持續性激活[20]，表現為機體持續的IFN抗病毒反應。

ISG化過程為可逆共價結合，去ISG化由泛素特異性肽酶18(ubiquitin specific peptidase 18，USP18)介導。USP18為ISG15的去共價結合蛋白酶，由usp18基因編碼，又稱為UBP43。缺失UBP43的小鼠對IFN-β刺激異常敏感，能誘導持續的STAT1酪氨酸磷酸化，激活IFN信號通路[3]。表明ISG化通過JAK/STAT信號通路激活IFN應答，且UBP43為ISG化的負調節因子。usp18基因敲除小鼠能抵抗淋巴細胞脈絡叢腦膜炎病毒的感染，抑制該病毒的復制，且機體表現出更高水平的ISG化[21]。不僅表明UBP43為降解ISG15類泛素化的蛋白酶，還再次證明ISG15介導的ISG化過程具有抗病毒作用。

2.2 ISG15的抗HIV作用及機制

研究顯示，胞外分泌的ISG15可能作為一種細胞因子或趨化因子發揮作用，從而調節免疫細胞的功能，這在HIV感染過程中表現得尤為復雜。Ⅰ型IFN誘導產生的ISG15能誘導LPS活化的CD3+T細胞分泌IFN-γ，并伴隨著吲哚胺2,3雙加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase，IDO)活性增強[22]，從而增強細胞毒性，表現出抗病毒效應。同樣，在B細胞刪除的原代培養條件下，ISG15能刺激CD3+T細胞產生IFN-γ，作用于NK細胞，促進NK細胞增殖及對HIV的殺傷能力[23]。研究人員通過體外T細胞和單核細胞系的HIV感染模型發現，HIV Tat蛋白存在時，轉導ISG15能顯著上調IFN信號通路活化，抑制HIV復制[24]。IFN-ω能顯著上調ISG15表達，并特異性抑制HIV復制[25]。小腸上皮細胞Toll 樣受體3(Toll-like receptor 3，TLR-3)信號通路活化后，誘導上皮細胞表達IRF3和IRF7并分泌趨化因子，釋放包含ISG15蛋白的外體，抑制HIV在巨噬細胞中的復制[26]。雖然ISG15對HIV的抑制作用明顯，但機制不清楚，可能是由于胞內因子之間的相互作用。

HIV的出芽釋放依賴蛋白運輸所需的內吞體分選轉運復合體(endosomal sorting complexes required for transport，ESCRT)，其中ESCRT-Ⅰ蛋白Tsg101的UEV結構域與HIV Gag蛋白的PTAP基序結合，介導HIV的出芽。ISG15則阻斷兩者相互作用，在一定程度上抑制了成熟HIV的出芽和釋放[16,27]，且這種抑制作用呈ISG15表達量依賴性[16]。這是目前唯一報道的ISG15直接抑制HIV復制的機制。近期有報道顯示，ISG化的E3連接酶HERC5能通過與HIV Gag蛋白相互作用，在不影響Gag蛋白從胞內到胞膜運輸途徑的情況下抑制多輪HIV復制[28]。提示在胞內ISG化抑制HIV成熟過程中，介導蛋白相互作用的分子可能不止一種。

2.3 HIV感染者隊列中ISG15的抗病毒作用

從轉錄水平來看，HIV感染者未經抗反轉錄病毒治療(antiretroviral therapy，ART)時ISG15的上調表達最明顯，經長期cART治療后，ISG15的表達量下調。在高病毒載量和低CD4 T細胞計數的患者中，ISG15表達量較高[29]。表明HIV感染者中ISG15表達與病毒載量呈正相關，與CD4 T細胞計數呈負相關，即感染者中ISG15轉錄水平與疾病進展一致。HIV感染者中，IP-10表達上調，導致患者免疫功能紊亂進而引發疾病進展。miR-21能抑制LPS活化的單核細胞上調表達IP-10，而HIV感染者體內的miR-21表達顯著低于健康人群，因此miR-21對IP-10的調節作用能有效延緩疾病進展。而在單核細胞分化為巨噬細胞的過程中，ISG15的表達顯著上調，伴隨miR-21對IP-10表達的調控作用減弱[30]。因此，ISG15可能是miR-21控制AIDS疾病進展過程中的關鍵角色。

健康細胞在免疫激活的情況下，ISG15的上調表達十分顯著[31]，顯示其對IFN的應答正常且迅速。但在HIV感染無癥狀期，ISG15的表達下調，且對IFN-α的應答能力減弱[32]，表明HIV感染造成了ISG15介導的IFN應答通路損傷。巨噬細胞為HIV的主要潛伏庫之一，HIV的功能性蛋白Vpr能在轉錄水平和蛋白水平誘導巨噬細胞中ISG15表達上調[33]。因此，ISG15的上調表達同步于HIV的擴增，為HIV感染后抗病毒效應的表現。研究者對HIV感染者的臨床信息進行生物信息學分析，發現HIV慢性感染者PBMC和T細胞中的ISG15表達均上調，且CD4 T細胞中ISG15作為IFN抗病毒信號通路中的關鍵分子，在抗HIV免疫應答中起主要作用[34]。由此可見，ISG15在HIV感染者中的功能遠比體外實驗復雜，包括對炎癥因子、IFN應答通路分子及非功能性小RNA等的調控。

3 HIV逃逸ISG15的抗病毒作用

慢病毒的功能輔助蛋白能特異性靶向宿主胞內限制因子，抑制其發揮抗病毒作用，從而增強病毒自身的復制能力。流感病毒NS1蛋白通過抑制UBE1L的催化反應來抑制ISG15與靶蛋白的共價結合[35]；嚴重急性呼吸綜合征(severe acute respiratory syndrome，SARS)病毒能編碼ISG15去結合酶[36]；牛痘病毒E3蛋白通過與ISG15結合而競爭性阻斷其抗病毒作用[37]；HCV通過誘導ISG15對RIG-Ⅰ泛素化來抑制IFN產生[38]，從而逃逸IFN的抗病毒作用。

研究顯示，HIV感染能下調未經活化的原代巨噬細胞中IFN刺激后ISG15的表達[39]。巨噬細胞對IFN免疫應答能力減弱，提示HIV可能通過某種途徑逃逸宿主免疫。P21為介導單核細胞分化成熟的細胞周期素依賴性激酶抑制劑，能抑制巨噬細胞和DC中HIV的復制。最新研究顯示，巨噬細胞中ISG15特異性水解酶USP18通過下調p21的表達，間接輔助HIV逃逸宿主免疫，增強其復制能力[40]。如前所述，IRF3能與ISRE特異性結合，誘導ISG15表達[10]，通過IFN信號通路發揮抗病毒作用。同時，ISG15抑制IRF3降解[41]，持續激活IFN的抗病毒免疫應答。而HIV的Vpr蛋白和Vif蛋白能通過泛素化誘導IRF3降解，負向調節機體的抗病毒反應[42]。ISG化能抑制HIV的出芽和釋放[27]。研究人員通過芯片矩陣分析發現，HIV的Vpu蛋白能靶向降解ISG15共價結合的E2連接酶UBE2L6，從而降低細胞整體ISG化水平，逃避宿主的免疫抑制作用[43]。

IFN-α的抗病毒作用在HIV感染者中并沒有得到很好的發揮，提示IFN-α信號通路很可能是HIV的靶標，HIV通過干擾IFN-α發揮抗病毒作用來逃避宿主免疫。HIV感染誘導ISG15的上調表達由STAT1/STAT3介導[44]。而HIV的Vif蛋白則通過降解JAK/STAT信號通路中的分子來抑制IFN-α的抗病毒作用，表現為ISG15的表達水平下降。Vif正是通過與STAT1和STAT3直接結合，借助泛素化途徑降解后者[45]，從而阻斷宿主的抗病毒反應。由此可見，HIV的非結構蛋白通過靶向宿主ISG化過程和拮抗IFN信號通路中的關鍵分子，阻斷ISG15對病毒復制的抑制，從而逃避宿主免疫。

4 結語

到目前為止，ISG15的抗病毒作用僅在人源細胞離體實驗及小鼠模型中得到驗證。由于缺乏HIV感染小鼠模型，而恒河猴感染模型操作復雜、周期較長， 導致ISG15抗HIV的功能目前只在體外細胞系模型中得到驗證。HIV感染者中，ISG15更有可能參與免疫功能調節，輔助宿主發揮抗病毒作用。胞外的ISG15誘導IFN-γ產生，介導機體的抗感染免疫；胞內的ISG15則誘導IFN信號通路活化，介導下游細胞因子分泌。ISG化在人體內可能并非抗病毒免疫調節中的唯一通路，因此研究人員發現ISG15缺失患者并未表現出對病毒易感性的增加，且IFN刺激也能誘導其他ISG表達，機體表現出更強的抗感染能力[46]。ISG15通過Ⅰ型IFN參與的免疫調節十分復雜，涉及宿主自身對病毒的限制作用及HIV逃逸宿主免疫。

ISG化及ISG15在HIV感染中的具體作用及機制尚未完全解析，其在宏觀水平對HIV復制的抑制作用表現出不同感染人群的差異性，在微觀水平的免疫調節信號通路更是錯綜復雜。因此，有必要進一步探索ISG15在HIV急性感染者、慢性感染者、長期不進展者和精英控制者中的作用和角色。此外，鑒于ISG15缺陷患者并未表現出病毒易感性增加，且ISG15的抗病毒作用均在小鼠模型中得到驗證，表明ISG15的種屬差異對其發揮免疫調節作用有至關重要的影響。因此，ISG15在HIV感染者中的作用可能不僅是抑制病毒復制，還有可能與其他IFN信號通路協同作用，參與不同細胞亞群的免疫調節。在明確ISG15對HIV感染不同時期的作用及可發揮作用的細胞群的前提下，探討其抗病毒效應的臨床應用前景，對尋求配合cART治療的HIV功能性治愈策略具有重要意義。