甲型流感病毒非結構蛋白NS1功能研究進展

劉瑞寒，朱汝南，錢淵

1. 北京協和醫學院研究生院首都兒科研究所病毒研究室，北京100730； 2. 首都兒科研究所病毒研究室，兒童病毒病病原學北京市重點實驗室, 北京 100020

流感病毒(influenza virus)是正黏病毒科(Orthomyxoviridae)流感病毒屬成員，為有包膜的單股負鏈分節段RNA病毒[1]。其具有極強的傳染性，可引起急性呼吸道傳染病。根據病毒顆粒中核蛋白(nucleoprotein，NP)和基質蛋白(matrix protein，M)抗原性的差異，流感病毒可分為甲(A)、乙(B)和丙(C)3種型別。其中甲型流感病毒(influenza A virus，IAV)是每年季節性流感的主要病原體，自1918年起在全世界范圍引起5次大的病原明確的暴發流行。IAV的非結構蛋白1(non-structural protein 1，NS1)與病毒-宿主相互作用關系最密切，是IAV感染過程中拮抗宿主天然免疫反應的主要病毒成分，也是影響流感病毒致病性和宿主適應性的關鍵毒力因素[2]。

IAV的NS1是由病毒第8節段RNA編碼的多功能調控蛋白，存在于病毒培養上清或被感染的細胞中，但不存在于病毒顆粒中。NS1通常含有215～237個氨基酸，包含兩個功能結構域，即N端的RNA結合域(RNA-binding domain，RBD)和C端的效應結構域(effector domain，ED)，兩個結構域之間由7～12個氨基酸的連接區(linker region，LR)連接[3]。NS1的功能主要依賴其蛋白-RNA、蛋白-蛋白相互作用，包括抑制干擾素(interferon，IFN)的轉錄表達；抑制IFN誘導的蛋白激酶R(protein kinase RNA-activated，PKR)和2′，5′寡聚腺苷酸合成酶(2′，5′-oligoadenylate synthetase，OAS)/核糖核酸酶L(ribonuclease L，RNase L)的抗病毒作用；激活磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)信號通路，抑制被感染細胞凋亡；調控病毒RNA合成及病毒RNA剪接，增強病毒蛋白質合成等；與宿主蛋白相互作用，調節病毒生物學特性。因此，深入了解NS1的生物學功能及其不同變異形式對功能的影響，將為設計新型抗病毒藥物和減毒疫苗奠定基礎。

1 NS1抑制IFN的轉錄表達

宿主細胞產生IFN是一種可有效限制病毒復制及傳播的抗病毒機制。病毒感染細胞后，經自分泌或旁分泌途徑產生的IFN可誘導宿主細胞產生300多種具有抗病毒作用的基因表達[4]。IAV的NS1抵抗宿主抗病毒應答效應主要表現在抑制IFN的合成及抑制IFN誘導表達的抗病毒基因ISG(interferon-stimulated gene)激活兩方面。這兩種功能主要由NS1的C端ED區執行，由于ED區存在多種變異形式，不同毒株的NS1對IFN合成及相關功能的抑制機制不同[5]。在自然環境或實驗室傳代過程中，NS1可丟失這些機制中的一種或全部。

1.1 NS1抑制IFN基因相關轉錄活化因子，降低IFN轉錄

病毒感染宿主細胞時，宿主細胞中的RNA解螺旋酶維甲酸誘導基因Ⅰ(retinoic acid-inducible gene Ⅰ，RIG-Ⅰ)可識別并結合至細胞內雙鏈RNA(double-stranded RNA，dsRNA)或5′端含有三磷酸基團的單鏈RNA(single-stranded RNA，ssRNA)，使自身發生ATP依賴的構象改變而暴露其N端CARD結構域(caspase recruiting domain)[6]，后者可被泛素連接酶TRIM25(tripartite motif-containing protein 25)[7]或Riplet/RNF135(RING finger protein 135)[8]泛素化，也可與TRIM25合成的多聚泛素鏈結合[9]。經泛素化修飾的RIG-Ⅰ CARD隨后與線粒體抗病毒信號蛋白(mitochondrial antiviral signaling，MAVS)的CARD結合，激活MAVS并使其發生低聚反應，進而激活其下游的多個激酶信號通路，最終導致細胞質中轉錄因子如干擾素調節因子3(interferon regulatory factor 3，IRF3)、核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)及c-Jun/活化轉錄因子2(activating transcription factor 2，ATF-2)的磷酸化激活及向胞核內的轉運[10]。這些轉錄活化因子在細胞核內的出現可大大增加IFN的轉錄表達。H5N1、2009 H1N1 pandemic(H1N1pdm)及2009年以前的部分H1N1亞型流感病毒的NS1，通過與 TRIM25 的卷曲螺旋域相互作用阻止其寡聚化而減少了RIG-Ⅰ的泛素化，進而抑制宿主細胞中IRF3、NF-κB及c-Jun/ATF-2的活化來減少IFN基因的轉錄[7]。當NS1出現S42P突變時，IAV在細胞培養中的增殖能力降低，不能發揮抑制宿主細胞表達IFN及降低IRF3磷酸化水平的作用[11]。

Kuo等發現，H3N2亞型流感病毒NS1雖然也可有效結合TRIM25，但不能抑制IRF3的激活及IFN的轉錄起始，表明NS1與TRIM25的結合并不是抑制IRF3激活所必需的[12]，因此NS1與TRIM25結合可能抑制了另外的由TRIM25激活的抗病毒信號通路。Riplet與NS1的結合僅在NS1可抑制IRF3活化的流感病毒亞型中出現，且NS1與Riplet的結合表現出明顯的種屬限制性，人流感病毒NS1僅能與人類表達的Riplet結合而抑制RIG-Ⅰ的泛素化，不能與豬或禽源Riplet結合[13]。此外，ATP依賴的RNA解螺旋酶LGP2(laboratory of genetics and physiology 2)也含有與RIG-Ⅰ相似的可識別并結合病毒RNA的結構域，但LGP2缺乏用來激活下游IRF3的可被泛素化的CARD。在無法抑制IRF3激活和IFN合成的H3N2亞型流感病毒感染的細胞中過表達LGP2，發現STAT1轉錄活化因子的激活受到抑制，且IFN的轉錄水平明顯降低；在可抑制IRF3激活和IFN合成的H1N1亞型流感病毒感染的細胞中過表達LGP2，卻沒有表現出相同的作用[14]。因此，NS1可抑制IFN基因相關的轉錄活化因子，減少IFN轉錄毒株亞型的差異及宿主差異，但具體機制仍不明確，需進一步研究。

1.2 NS1抑制宿主細胞pre-mRNA的加工成熟，減少胞質中IFN翻譯模板

剪切和多聚腺苷酸化特異性因子(cleavage and polyadenylation specificity factor，CPSF)的相對分子質量為 30 000 的亞基即CPSF30，具有在細胞核內裂解宿主pre-mRNA并對裂解的pre-mRNA進行聚腺苷酸化的作用，是宿主細胞內pre-mRNA 3′端加工成熟的必要蛋白酶[15]。隨后，多聚腺苷酸結合蛋白2 [poly(A)-binding protein 2,PABP2]和poly(A)聚合酶共同對帶有10～12個腺苷酸尾的pre-mRNA進行進一步的加A延伸，完成對細胞核內pre-mRNA的加工[16]。NS1可通過以下3種方式抑制宿主細胞pre-mRNA的加工成熟，減少胞質中IFN翻譯模板，從而降低被感染細胞中IFN的表達。首先，NS1的ED區與CPSF30的鋅指結構F2F3結合，使后者不能與pre-mRNA結合[17]，未加工的pre-mRNA在細胞核中大量聚集，胞質中成熟mRNA大量減少，其中包括IFN及多種具有抗病毒作用蛋白的mRNA[18]；其次，ED區與PABP2結合影響poly(A)延伸，造成pre-mRNA多以10～12個腺苷酸為尾部結構的現象，無法進行核輸出而聚集在細胞核內；最后，NS1與PABP2結合也能抑制3′端已完成加工的mRNA的核輸出，導致更多的宿主mRNA滯留在細胞核內[16]。

NS1與CPSF30相互作用的區域為第184～188位氨基酸，第184位甘氨酸被精氨酸置換后，NS1與CPSF30的結合能力消失；第187位疏水性色氨酸是ED區形成二聚體的必需氨基酸位點，不直接影響兩者的結合，但可通過改變ED的空間構象影響NS1的功能；在兩者結合區域外的第103位苯丙氨酸和第106位蛋氨酸雖然不直接參與NS1與CPSF30的結合，但可使NS1與CPSF30的結合更穩定[19]。

不同亞型的流感病毒其NS1與CPSF30的結合抑制pre-mRNA加工成熟的作用也存在差異。H3N2和H2N2亞型流感病毒的NS1雖不能抑制宿主細胞中IRF3等IFN相關轉錄活化因子的激活，但其與CPSF30結合可抑制IFN pre-mRNA的成熟而減少宿主細胞內IFN的合成[12]。相反，H1N1pdm亞型流感病毒中，前面提到的3個位點的氨基酸均不利于NS1與CPSF30結合，各位點發生相應氨基酸突變后，大大降低了該亞型流感病毒在小鼠體內的致病力及復制能力[20]。1997年，在中國香港地區分離得到的H5N1亞型流感病毒NS1中，第103位和第106位氨基酸分別是亮氨酸和異亮氨酸，將兩個位點的氨基酸分別用苯丙氨酸和蛋氨酸替代后，體外細胞培養中病毒的復制能力提高了近20倍[21]。

1.3 NS1的組蛋白模擬功能抑制宿主基因轉錄

1989年以后分離的H3N2亞型流感病毒NS1的C端第226～229位氨基酸為ARSK序列，該氨基酸序列與組蛋白H3K4的N端ARTK序列相似，因此宿主細胞內的甲基化酶會錯誤地識別NS1的ARSK序列，且甲基化其最后一位賴氨酸[22]。甲基化修飾后的NS1具有模擬組蛋白的功能，與hPAF1C結合，抑制hPAF1C介導的轉錄延伸機制，抑制包括抗病毒基因在內的一些誘導表達基因的轉錄。NS1的C端缺失ARSK序列后，便喪失了該功能。NS1的組蛋白模擬功能抑制基因轉錄在一定程度上彌補了H3N2亞型流感病毒NS1缺失的通過IRF3途徑抑制IFN表達的作用[23]。

2 NS1抑制IFN誘導的PKR和OAS活化

NS1拮抗IFN抗病毒作用除表現在其對IFN轉錄前及轉錄后的抑制作用外，還可與IFN誘導表達的ISG產物直接結合，抑制ISG的抗病毒作用。目前研究較多的兩種ISG分別是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶PKR及 RNAse L通路活化的OAS。

2.1 NS1抑制IFN誘導的PKR活化

PKR是一種在哺乳動物細胞中構成性表達并依賴dsRNA的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，IFN會增加其表達水平[24]。PKR可被dsRNA或細胞內PACT(PKR-associated activator)激活，解除PKR的自我抑制使其自身發生磷酸化，隨后將包括真核起始因子2(eukaryotic initiation factor 2，eIF2)α亞基(eIF2α)在內的靶蛋白進行磷酸化[25]。磷酸化的eIF2α功能失活，被病毒感染的細胞中所有蛋白的合成均受到抑制，病毒自身蛋白質的合成也受到抑制。但IVA感染細胞中PKR沒有表現出激活形式[26]，RBD缺失的NS1毒株感染細胞后PKR依然沒有表現出激活的作用，因此研究者推測NS1 ED區可直接結合PKR，以不依賴dsRNA的方式抑制PKR的構象向活化形式改變[27]。Min等則報道，NS1第123～127位氨基酸與PKR的連接區相互作用，抑制了由dsRNA或PACT引起的PKR構象改變[28]。

2.2 NS1抑制IFN誘導的OAS活化

含有2′-5′磷酸二酯基團的寡核苷酸是病毒復制的副產物， OAS可將ATP聚合進入這些副產物，合成2′-5′寡腺苷酸鏈(2′-5′A)。細胞中的dsRNA可活化OAS，使其發揮在2′-5′磷酸二酯鍵后加入多聚腺苷酸鏈的作用。隨后2′-5′A可結合并活化細胞中構成性表達的RNase L，后者能裂解病毒及宿主細胞中的ssRNA，從而抑制病毒復制；同時，RIG-Ⅰ可識別并結合經RNase L裂解產生的小片段RNA，進而增加IFN的轉錄表達，形成對IFN表達的正反饋[29]。流感病毒NS1的RBD與dsRNA的結合能力稍強，可與OAS競爭性結合dsRNA，而抑制OAS/RNase L信號通路激活。當NS1的RBD第38位氨基酸由精氨酸突變為丙氨酸時，喪失了與OAS競爭性結合RNA的能力，病毒復制減少[30]。

3 NS1激活PI3K/Akt信號通路， 抑制病毒感染引起的細胞凋亡

PI3K是一種由相對分子質量分別為 85 000 的調節亞基(p85)和 110 000 的催化亞基(p110)組成的異二聚體脂質激酶[31]。PI3K活化后，可產生 胞內第二信使——三磷酸磷脂酰肌醇[phosphatidylinositol (3,4,5)-trisphosphate，PIP3]，隨后PIP3募集胞膜上一系列下游信號蛋白。絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶Akt是PIP3結合的PI3K效應器。PI3K/Akt信號通路的激活抑制了凋亡蛋白Caspase-9和調控細胞代謝的GSK-3β的活化，進而抑制細胞的凋亡程序[32]。NS1的ED區與p85β-SH2及p110結合，解除了p85β對p110α的抑制，激活了PI3K/Akt信號通路，抑制了流感病毒感染誘導的細胞凋亡程序，為病毒在宿主細胞內復制提供了有利條件[33]。將第89位保守表達的酪氨酸替換為苯丙氨酸后，NS1失去了與p85β結合及活化PI3K/Akt的能力[34]，細胞被感染后很快進入凋亡程序，不利于流感病毒在細胞中復制。此外，NS1還可與Crk/CrkL的N端SH3結構域結合激活PI3K，進而對Akt進行磷酸化激活，該相互作用需NS1第215位氨基酸為脯氨酸，多見于禽流感病毒[35]。因此，IAV感染宿主細胞時，NS1可在PI3K/Akt信號通路中多環節調節宿主細胞對病毒感染的應答。

4 NS1促進病毒mRNA和蛋白的合成

NS1可使大量宿主pre-mRNA滯留在細胞核內，病毒的帽依賴性內切酶可將宿主pre-mRNA上多腺苷酸帽切下來，作為合成病毒mRNA的引物，促進病毒mRNA的合成[36]。流感病毒感染宿主后，其NS1可特異性識別并結合含有5′-非翻譯區(5′-untranslated region，5′-UTR)的病毒mRNA，大量轉錄病毒mRNA。NS1的N端第81～113位氨基酸可與轉錄起始因子eIF4GI結合，將eIF4GI募集并結合到病毒mRNA的5′-UTR區以增強病毒mRNA的轉錄[37]。同時，NS1的N端第81位氨基酸可與PABP1結合，PABP1與eIF4GI有協同作用，三者形成NS1-PABP1-eIF4GI復合物，共同促進病毒mRNA的轉錄[38]。hStanfen是一種可以與dsRNA及微管蛋白結合的蛋白，通過其微管運輸功能將病毒mRNA運輸至翻譯場所，如多聚核糖體[39]。因此，NS1通過與病毒mRNA 5′-UTR、eIF4GI、PABP1和hStanfen的相互作用，募集病毒mRNA，形成多蛋白的轉錄起始復合物，增強病毒mRNA的轉錄。近期有研究發現，NS1還可與DDX21結合，后者是細胞表達的解螺旋酶，可通過結合PB1抑制病毒聚合酶復合體的形成而發揮抑制病毒基因復制的功能，但NS1與DDX21的結合解除了其對病毒復制的抑制作用[40]。

5 NS1 C端PDZ結合基序影響毒株毒力

大規模序列分析發現，禽流感病毒NS1的C端最后4個氨基酸XSXV/XTXV是潛在的PDZ(postsynaptic density protein)結合基序(PDZ-binding motif，PBM)[41]。含PDZ區域的蛋白通過蛋白-蛋白識別模式可整合調控多條信號通路，特異性結合4～5個氨基酸的短的C端短肽類基序，進而結合一系列靶蛋白或將蛋白低聚化形成分支。含PDZ區域的蛋白功能涉及多方面，包括物質運輸、定位、分子信號復合物的組裝、組織細胞極性、受體結合和下游效應器激活[42]。IAV的NS1可與含PDZ區域的Scribble 和 Dlg1蛋白結合，抑制病毒感染過程中的天然免疫反應[43]。90%的人流感病毒NS1的C端PBM為RSKV/RSEV，而禽流感病毒則為ESEV/EPEV。目前已知的可與禽流感病毒NS1 PBM結合的含PDZ的蛋白質約有30種，但與人流感病毒NS1 PBM結合的含PDZ的蛋白質還未被發現[41]。Jackson等為驗證以上兩類NS1 PBM的功能差異，利用反向遺傳技術將1918 H1N1和高致病性禽流感病毒H5N1的PBM表達于A/WSN/33毒株，發現與野生型A/WSN/33相比，改造后的毒株表現出對小鼠更強的致病性和更高的致死率[44]。

6 NS1與抗病毒藥物和減毒活疫苗研制

NS1在拮抗宿主抗病毒反應和促進病毒自身基因轉錄表達方面均表現出重要作用，成為近年來抗病毒藥物及減毒活疫苗研制的主要方向。目前，研究者可通過計算機預測和識別大量來自不同亞型毒株的NS1結構及潛在的化學抑制劑結合位點，同時也有多種方法可檢測抑制劑的效果。通過比較不同亞型不同毒株NS1基因和蛋白，研究者發現NS1結合dsRNA的能力是其最保守的功能。Cho等和Maroto等分別用熒光和放射性元素標記RNA，監測在不同抑制劑作用下NS1與RNA結合的能力是否受影響，結果證明EGCG和35S-vNSZ兩種化學物質均可有效抑制NS1與dsRNA的結合而發揮各自的抗病毒作用[45-46]。Basu等使用以酵母為基礎的表型互補實驗，識別酵母中有多個可逆轉NS1調控的抑制復制的小分子化學物質[47]。其中一個小分子化合物JJ3297表現出明顯的抗病毒活性，允許在表達NS1基因的流感病毒感染的細胞中表達IFN和激活RNase L[48]，但其抗病毒作用是直接抑制病毒感染過程中的NS1功能還是通過其他機制尚無定論。

NS1基因表達完全缺失或表達截短的NS1基因均可使病毒在宿主體內的復制能力降低，但并不影響病毒本身誘發宿主產生強烈的天然免疫反應[49]。這種因NS1表達缺陷而表現為毒力減弱、復制能力降低及免疫反應誘導作用較強的毒株的發現，為通過改造NS基因研制減毒活疫苗的想法提供了理論依據。一系列利用反向遺傳技術表達NS1 C端缺失的減毒活疫苗在小鼠、豬、馬、禽類、雪貂和獼猴中均表現出良好的保護作用[50]。近期一項禽流感疫苗研究表明，于鼻內接種表達NS1缺陷的減毒活疫苗后再皮下接種滅活疫苗，不僅能增強黏膜抗體反應，升高血清抗體效價，還能增強抗體與異種抗原的交叉反應，提供更好的異源性保護[51]。在 15～50歲健康志愿者中進行NS1表達缺陷疫苗的Ⅰ期臨床試驗中，該疫苗同樣表現出良好的安全性及有效的免疫原性[52]。

7 結語

NS1除與上述宿主細胞表達的蛋白相互作用，亦可與病毒自身表達的多種蛋白相結合，在宿主適應[53]和流感病毒的空氣傳播[54]過程中發揮不容忽視的作用。針對NS1拮抗宿主抗病毒作用機制的相關研究已持續了十幾年，這個相對分子質量僅為 26 000 的小蛋白幾乎參與了流感病毒感染宿主細胞的各階段，因此有必要對NS1進行更深入的系統研究，以期為更好地預防和控制流感病毒傳播甚至暴發奠定堅實的基礎。