影響金黃色葡萄球菌殺白細胞素ED轉錄表達的培養條件

楊涵，黃凱峰，徐溯，趙煥強，徐曉剛，胡付品，何春燕，龔芳，劉慶中

1. 上海交通大學附屬第一人民醫院檢驗醫學中心，上海 200080； 2. 復旦大學附屬華山醫院抗生素研究所，上海 200040； 3. 南通大學附屬南通第三醫院檢驗科，江蘇 南通 226000

金黃色葡萄球菌是醫院和社區感染的重要病原體之一，可引起壞死性肺炎、中毒性休克綜合征、化膿性感染等疾病，這與其分泌的多種毒素因子密切相關[1-3]，其中雙組分成孔殺白細胞素(leukocidin)發揮著重要作用。金黃色葡萄球菌能分泌6種雙組分殺白細胞素：Panton-Valentine殺白細胞素(Panton-Valentine leukocidin，PVL；也稱LukSF-PV)、殺白細胞素ED(leukocidin ED，LukED)、γ溶血素(包括HlgAB和HlgCB)、殺白細胞素AB(leukocidin AB，LukAB；也稱 LukGH)及殺白細胞素MF′(leukocidin MF′，LukMF′)[2,4-5]。這些毒素均由兩個獨立的水溶性亞基S和F組成。細菌感染過程中，S亞基首先識別宿主細胞膜，隨后募集F亞基形成橫跨細胞膜的β桶狀孔，從而引起宿主細胞膜破裂, 導致細胞死亡[6-8]。

一直以來，PVL是金黃色葡萄球菌毒力的研究熱點[9]。近幾年來，LukED在金黃色葡萄球菌致病機制中的重要作用得到越來越多實驗的證實。研究表明，LukED可與巨噬細胞、T細胞和樹突細胞表面的趨化因子受體CCR5，中性粒細胞、單核細胞和自然殺傷細胞表面的CXCR1/2受體及紅細胞表面的DARC受體結合，引起相應靶細胞裂解，促進感染發生[10-13]。LukED皮內注射兔子可引起明顯的局部炎癥和皮膚壞死反應，毒性程度與PVL引起的皮膚壞死相當[14]。小鼠血流感染模型中，金黃色葡萄球菌lukED缺失突變株(ΔlukED)感染小鼠的生存率明顯高于野生型菌株，其肝、腎等器官中細菌復制能力降低，白細胞介素6(interleukin 6，IL-6)和粒細胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor，G-CSF)減少[15]。流行病學資料顯示，LukED與金黃色葡萄球菌所致膿皰病、抗生素相關性腹瀉密切相關，且在臨床金黃色葡萄球菌中呈現較高的流行率[4-5,16]。

LukED表達受培養基、生長階段等多種因素的影響。Gravet等[14]研究顯示，LukED在腦浸液培養基中檢測不到，而在酵母提取物-酪蛋白氨基酸-丙酮酸鈉(yeast extract-casamino acids-sodium pyruvate，YCP)培養基中可檢測到。Bronner等[17]采用半定量反轉錄-聚合酶鏈反應(semi-quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction，SqRT-PCR)檢測YCP及其他培養基中各毒素表達情況，但準確率欠佳，且缺乏深入研究。因此，本實驗擬研究5種常用培養基及細菌生長階段對lukED轉錄的影響，探討培養基組分對lukED轉錄的影響，為后續LukED研究獲得足量毒素奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗菌株金黃色葡萄球菌Newman菌株由復旦大學附屬華山醫院抗生素研究所保存及惠贈。

1.1.2培養基腦心浸液肉湯(brain heart infusion broth，BHI)、胰蛋白胨大豆肉湯(tryptic soy broth，TSB)、溶菌肉湯(lysogeny broth, LB)及Mueller-Hinton肉湯(Mueller-Hinton broth，MHB)購自英國Oxoid 公司。YCP [30 g/L酵母提取物、20 g/L酪蛋白氨基酸、20 g/L丙酮酸鈉、2.5 g/L Na2HPO4、0.42 g/L KH2PO4，pH 7.0]為本實驗室自行配制，其中酵母提取物購自Oxoid 公司，酪蛋白氨基酸購自美國Amreso公司，丙酮酸鈉、Na2HPO4和KH2PO4購自生工生物工程(上海)股份有限公司。向LB培養基(10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L氯化鈉)中分別加入YCP培養基各成分(終濃度與YCP一致)，配制新的培養基并分別命名為LBY(LB+25 g/L酵母提取物)、LBC(LB+20 g/L酪蛋白氨基酸+2.5 g/L Na2HPO4+0.42 g/L KH2PO4；實驗過程中發現，只向LB中添加酪蛋白氨基酸難以溶解，因此將無機鹽一并加入助其溶解)、LBP(LB+20 g/L丙酮酸鈉)。

1.1.3主要試劑及儀器熒光定量 PCR儀及 NanoDrop2000 超微量分光光度計為賽默飛世爾科技有限公司產品，PCR 8連管及 96 孔板為Axygen 公司產品，紫外分光光度計為尤尼柯公司產品，蛋白酶K、RNA 抽提試劑盒MiniBEST Universal RNA Extraction Kit、反轉錄試劑盒PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser及熒光定量試劑盒TB Green Premix Ex Taq(Tli RNaseH Plus)購自寶生物工程(大連)有限公司，引物合成及溶葡萄球菌酶由生工生物工程(上海)股份有限公司提供，金黃色葡萄球菌裂解液由本實驗室自行配制(專利號ZL201310124795.2)。

1.2 方法

1.2.1生長曲線測定挑取新鮮Newman菌株的單個菌落至3 mL TSB中，37 ℃，150 r/min培養過夜。隨后吸取300 μL菌液至30 mL新鮮培養基中(1∶100稀釋)，37 ℃，150 r/min培養，每隔1 h取樣測定OD600值，監測細菌生長情況。

1.2.2qRT-PCR檢測lukE基因表達收集TSB、BHI、YCP、MHB和LB五種培養基中對數生長早期(TSB、BHI、YCP和MHB為3 h，LB為5 h)、中期(TSB、BHI和YCP為4 h，MHB為5 h，LB為7 h)、晚期(TSB、BHI和YCP為5 h，MHB為7 h，LB為9 h)及平臺期(TSB、BHI和YCP為7 h，MHB為9 h，LB為11 h)菌液，4 ℃，12 000 r/min離心10 min，棄上清液，用含100 μL裂解液、10 μL蛋白酶K和10 μL溶葡萄球菌酶的溶液重懸菌體，56 ℃裂解1 h。用MiniBEST Universal RNA Extraction Kit提取細菌RNA，去除基因組DNA后，反轉錄為cDNA。以16S rRNA為內參基因，qRT-PCR測定lukE基因mRNA表達(TB Green Premix Ex Taq)(LukED由共轉錄于一條mRNA的lukE和lukD兩個基因編碼，因此檢測lukE基因可反映lukED的表達)。引物序列見表1[18-19]。

表1 qRT-PCR引物序列

為研究YCP培養基成分對lukE基因表達的影響，分別檢測Newman菌株于LBY、LBC和LBP培養基5 h培養物中lukEmRNA，以LB和YCP培養基同一時間的培養物為對照。

1.3 統計學分析

用SAS軟件進行統計學分析，兩樣本比較采用t檢驗，兩個以上樣本的比較采用方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 生長曲線

Newman菌株在TSB、BHI、YCP、MHB和LB培養基中的生長曲線(圖1A)顯示，其在BHI、TSB和YCP培養基中生長速度較快，2～3 h后進入對數生長期，7～9 h后進入平臺期；在MHB和LB培養基中生長較慢，3～4 h后進入對數生長期，12 h后進入平臺期。

Newman菌株在LB、LBY、LBC及LBP培養基中的生長曲線(圖1B)顯示，添加酪蛋白氨基酸的LBC培養基中細菌生長速度最快，6～8 h進入平臺期；添加酵母浸出物(LBY)或丙酮酸鈉(LBP)的培養基中細菌生長較LB稍好。

2.2 生長階段對lukE表達的影響

根據圖1A中的生長曲線，挑選TSB、BHI、YCP、MHB、LB培養基中對數生長早期、中期、晚期及平臺期細菌進行研究。在TSB、BHI和YCP培養基中，從對數生長早期到晚期，lukE基因表達顯著增加，并在對數生長晚期達到最高水平(圖2A、2B、2C)。相對于對數生長早期，對數中、晚期變化倍數分別為TSB：4.48 和 7.82；BHI：4.90 和 6.90；YCP：3.97 和 7.71(P<0.05)。隨后進入平臺期，lukE基因轉錄水平顯著下降，與對數生長早期水平相當(P>0.05)。在MHB培養基中，對數生長早、中、晚期lukE基因表達無顯著差異，而平臺期顯著增加(為對數早期的 3.85 倍)(P<0.05)(圖2D)。在LB培養基中，lukE基因表達在整個生長周期中雖有增加趨勢，但差異沒有統計學意義(P>0.05)(圖2E)。

圖1 金黃色葡萄球菌Newman菌株在不同培養基中的生長曲線

The data are presented as mean±SD (3 independent experiments). Statistical analyses were performed with t-test and one-way analysis of variance followed by Bonferroni posttest. *P<0.05. A: Tryptic soy broth (TSB). B: Brain heart infusion broth (BHI). C: Yeast extract-casamino acids-pyruvate (YCP). D: Mueller Hinton broth (MHB). E: Lysogeny broth (LB). EE, early-exponential phase; ME, middle-exponential phase; LE, late-exponential phase; ST, stationary phase.

2.3 培養基對lukE表達的影響

表2比較了各培養基中lukE表達的差異。可看出，YCP培養基中lukEmRNA水平在各生長時期均顯著高于TSB和BHI培養基中對應時期：在對數生長早期，YCP培養基中lukE表達量是TSB的 4.73 倍，是BHI的 3.85 倍；在對數生長中期，YCP培養基中lukE表達量是TSB的 4.19 倍，是BHI的 3.11 倍；在對數生長晚期，YCP培養基中lukE表達量是TSB的 4.66 倍，是BHI的 4.28 倍；在平臺期，YCP培養基中lukE表達量是TSB的 10.03 倍，是BHI的 4.80 倍(P<0.05)。比較TSB與BHI培養基，發現對數中期和平臺期中lukE表達水平在BHI培養基高于TSB培養基(P<0.05)，對數早期和對數晚期無顯著差異(P>0.05)。LB培養基中lukE基因表達水平較低：lukE在LB培養基中的表達量在對數生長早期是TSB的 0.50 倍(P>0.05)，在對數生長中期是TSB的 0.17 倍(P<0.05)，在對數生長晚期是TSB的 0.13 倍(P<0.05)，而在平臺期是TSB的 1.68 倍(P<0.05)。MHB培養基中lukE表達最低：lukE在MHB培養基中的表達量在對數生長早期是TSB的 0.25 倍(P<0.05)，在對數生長中期是TSB的 0.11 倍(P<0.05)，在對數生長晚期是TSB的 0.05 倍(P<0.05)，而在平臺期與TSB無顯著差異(P>0.05)。

上述結果表明，YCP培養基最適合lukE表達。本研究進一步探討了YCP培養基中何種成分促進lukE基因表達水平。圖3顯示，LBY、LBC、LBP培養基中lukE表達水平分別是LB的 4.98、6.46 和 3.15 倍 (P<0.05)，表明加入LB培養基中的酵母浸出物、酪蛋白氨基酸和丙酮酸鈉均可促進lukE基因表達。統計學分析顯示，LBY與LBC培養基之間lukE表達無顯著差異(P>0.05)，但均顯著高于LBP培養基(P<0.05)。

表2 Newman菌株lukE基因在各培養基不同生長階段中的相對表達量

The data are presented as mean±SD (3 independent experiments). Statistical analyses were performed witht-test and one-way analysis of variance followed by Bonferroni posttest.*P<0.05 compared with TSB medium in the same growth phase.

The data are presented as mean±SD (3 independent experiments). Statistical analyses were performed with t-test and one-way analysis of variance followed by Bonferroni posttest. *P<0.05 compared with LB group, #P<0.05 compared with LBP group.

3 討論

金黃色葡萄球菌LukED毒素于1998年由Gravet等發現[14]，隨后發現其在金黃色葡萄球菌致病機制中發揮重要作用[4-5,20]，并可能成為金黃色葡萄球菌感染抗毒素治療的潛在新靶點。因此，如何在體外獲得大量LukED，對其研究非常必要。

本研究顯示，在細菌不同生長階段lukE基因的表達有較大差異，推測可能與細菌群體感應系統有關。金黃色葡萄球菌具有多種調控系統，包括雙組分信號調節系統(如Agr)和轉錄因子(如Rot)等。Agr系統通過群體感應機制進行調控[21]，細胞生長起始時密度低，細菌產生的自誘導肽(autoinducing peptide，AIP)濃度也低，Agr系統低表達。細胞生長至一定密度時，AIP達到閾值濃度，Agr系統表達增加，效應分子RNAⅢ表達增加，促進毒素表達。研究表明，Agr通路能有效調節LukED毒素的產生[15]。Alonzo等[15]分別用金黃色葡萄球菌Newman野生株、agr敲除株(Δagr)感染小鼠，發現Δagr菌株LukED表達量大大降低，毒力明顯減弱，小鼠耐受而不發生感染。因此推測，細菌生長階段對lukE表達的影響可能部分是通過群體感應系統實現的。Newman菌株在對數生長早期時Agr系統低表達，lukE表達也保持在低水平；至對數中、晚期，細菌產生的AIP增多，Agr系統表達增加，lukE表達增加；而在平臺期lukE表達驟減，可能與核糖核酸酶水平升高、細菌營養不足及mRNA不穩定等因素相關[22]。

本研究結果顯示，培養基組成對Newman菌株lukE的表達有重要影響。在TSB、BHI、YCP、MHB和LB五種培養基中，YCP最有利于lukE表達，TSB和BHI中lukE表達尚可，而MHB和LB中lukE表達非常低。YCP培養基主要由酵母浸出物、酪蛋白氨基酸和丙酮酸鈉構成。酵母浸出物是一種以面包酵母、啤酒酵母或葡萄酒酵母為原料，通過自溶、酶解等工藝制成的富含蛋白質、多肽、氨基酸、維生素及微量元素的產品，是微生物培養的優質氮源[23]。提高酵母浸出物的濃度能增加細菌營養，促進細菌生長，從而促進毒力基因表達。這可能是LB培養基中雖然含有酵母提取物，但濃度較低，致使lukE表達較低的原因。酪蛋白氨基酸富含氨基酸，常用于配制培養基，用于金黃色葡萄球菌培養。丙酮酸鈉是重要的中間代謝物，具有抗氧化性，在異養細菌培養中可替代葡萄糖作為碳源[24]。研究表明，丙酮酸鈉可有效消除過氧化氫對細菌的損傷作用[25]，添加了 0.3% 丙酮酸鈉的TSB培養基可使非可培養狀態(viable but non-culturable，VBNC)的金黃色葡萄球菌恢復生長[26]。本研究顯示，向LB中分別添加酵母浸出物、酪蛋白氨基酸和丙酮酸鈉均能促進lukE基因表達，但前兩者的促進效果明顯強于后者。

類似地，CCY培養基一直被認為是產生PVL的最佳培養基[27]，其組分包括30 g/L酵母浸出物、20 g/L酪蛋白氨基酸、23 g/L丙酮酸鈉、6.3 g/L Na2HPO4、0.41 g/L KH2PO4，pH 6.7[27]。比較CCY與YCP配方，發現兩者很相似，只有丙酮酸鈉及Na2HPO4的含量有區別，KH2PO4的含量輕微不同。推測營養豐富的培養基更有利于殺白細胞毒素的表達。

總之，本研究表明對數生長后期是lukED表達的最佳時期，相較于TSB、BHI、LB和MHB培養基，YCP培養基最適合lukEDmRNA表達，其中酵母浸出物和酪蛋白氨基酸是促進lukEDmRNA表達的主要成分。