泗陽縣水產養殖常見致病性菌對藥物感受性特點以及結果分析

李曉麗，馮龍，陳瑜，李勇

（泗陽縣水產技術指導站，江蘇 泗陽 223700）

近年來，泗陽縣水產養殖業發展迅速，但每年細菌性病害對我縣水產養殖都會造成一定的損失，給廣大養殖戶帶來了一定的經濟損失，甚至極少數養殖戶養殖全軍覆沒，損失慘重，嚴重打擊了養殖戶的積極性。對病原菌的分離、鑒定和藥物敏感性實驗可有效的防止藥物的濫用和誤用。

為了指導轄區各漁場防控細菌性病害并科學選擇和實驗水產藥物，2018年4月至11月，泗陽縣水生動物疫病防控中心對縣域內水產主要養殖品種進行了疫病監測，并對其感染致病性菌株進行了形態、生理生化特征、藥物敏感性試驗等研究，以期為泗陽縣水產養殖細菌性疾病的病原和防控提供科學數據和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

來自泗陽縣盧集鎮、穿城鎮、三莊鄉、史集街道辦、城廂街道辦、愛園鎮等漁場的多個發病養殖塘口，采集活力差、表皮充血、黑頭、溜邊等瀕臨死亡的水產樣品。

營養肉湯、營養瓊脂、TCBS瓊脂、脫脂奶蔗糖胰蛋白胨瓊脂購于北京路橋。氧化酶試劑盒購于杭州某公司，腸桿菌和其他非苛養革蘭氏陰性桿菌鑒定試劑盒（比色法）（英文名API 20E）購于上海某公司，動物用藥敏分析試劑板購于南京某醫療科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細菌的分離純化 樣品先用酒精棉擦拭，用滅菌的鑷子和剪刀取適量病變組織、內臟、血液、鰓等放于營養湯，置于28℃恒溫培養箱中培養18～24 h。在無菌條件下，用滅菌的接種環取培養液劃線接種于普通營養瓊脂培養基上，置于28℃恒溫培養箱中培養18～24 h。觀察菌落形態，并挑取可疑單個菌落劃線接種在TCBS培養基和脫脂奶蔗糖胰蛋白胨瓊脂培養基上，分別置于37℃和28℃恒溫培養18～24 h。

1.2.2 API試劑條微生物鑒定 用滅菌吸管挑取單個菌落至0.85%的NaCl中制成菌液，將5 mL無菌水放進培養盒里，將試劑條放進培養盒內，將菌液接種到小管或者小管及小杯（CIT，VP和GEL），利用礦物油覆蓋制定的生化孔（有劃線的孔）ADH、ODC、H2S和URE。蓋上培養盒，于35～37℃孵育18～24h，同時做氧化酶試驗構成第21個試驗。孵育后根據判讀表判斷個反應結果，參照生化譜手冊，得到鑒定結果，同時參照NCCLs和CLSI標準對藥物的敏感性及耐藥性進行判斷。

1.2.3 病原菌的藥敏試驗 該試驗分別對30株致病性嗜水氣單胞菌、3株副溶血弧菌和3株氣味沙雷氏菌進行了抗菌素感受性試驗。試驗步驟如下：挑取純化后的單個菌落于5 mL生理鹽水中，制成0.5麥氏單位濃度的菌懸液制成A管；取2支10 mL的無菌生理鹽水，打開任意一瓶，以無菌的方式向陰性對照孔分別加入200 μL的無菌生理鹽水；從A管中吸取200 μL菌懸液加入到打開的10 mL無菌生理鹽水中制成B管。將B管所有菌液倒入到經滅菌的V形槽中，再將另一支10 mL無菌生理鹽水倒入V形槽中。混均后，利用微量移液器吸取V形槽中的菌液加入到所有微孔中（陰性對照除外）200 μL；將加樣好的藥敏分析試劑板放入28℃的恒溫培養箱中培養24～28 h，經肉眼觀察證實無細菌生長試管中的最低藥物濃度，孔內液體渾濁為陽性（+），孔內液體澄清為陰性（-），最低藥物濃度即藥物的最小抑菌濃度（MIC）。

表1 病原微生物檢測采樣品種和數量匯總表

2 試驗結果

2.1 具體的采樣地點、品種和數量

2018年4—11月在全縣的13個養殖場塘口抽檢76個樣品，其中河蟹31個，草魚29個，鯽魚11個，小龍蝦5個。如表1所示。

2.2 病原菌的分離及形態特征觀察

分離的出的細菌在基礎培養基營養瓊脂上為光滑、濕潤、微凸、無色或淡黃色菌落，在大部分脫脂奶蔗糖胰蛋白胨瓊脂平板上，菌落周圍出現明顯的、透明的蛋白溶蛋白圈，在TCBS上成圓形、半透明、表面光滑的綠色菌落。

2.3 API試劑條微生物鑒定結果

試驗分離出60個細菌分離株，陽性檢測率78.95%。分別確定嗜水氣單胞菌45株，占陽性檢出率的75%，副溶血弧菌3株，占陽性檢出率的5%，氣味沙雷細菌4株，占陽性檢出率的6.67%，如表2所示。還有未在表中列出的草魚中檢測出的土生拉烏爾菌、紫色色桿菌、腦膜膿毒性金黃桿菌各1株，河蟹中檢出的阪崎腸桿菌、創傷弧菌、枸櫞酸桿菌、布式檸檬酸桿菌、霍式格里蒙菌各1株，16株未知菌株。

30株致病性嗜水氣單胞菌、3株副溶血弧菌和3株氣味沙雷氏菌對8種抗菌藥物的感受性性測定結果分別如表3、表4和表5所示。

表2 常見的水產病原細菌陽性檢測結果匯總表

3 討論與分析

試驗用30株致病性嗜水氣單胞菌、3株副溶血弧菌和3株氣味沙雷氏菌對8種抗菌藥物進行敏感性測定，對水產選用抗生素具有一定的參考價值。試驗數據分析，采樣分離到的的病原菌對不同抗菌素藥物表現出了不同度的感受性和耐藥性。30株嗜水氣單胞菌對硫酸新霉素最敏感，敏感菌株率為100%，其次對氟苯尼考、乳酸環丙沙星、恩諾沙星和強力霉素敏感菌株率分別為96.7%、93.3%、90%和83.3%。但對紅霉素最不敏感，耐藥菌株率達93.3%，其次是甲砜霉素，耐藥菌株率達83.3%。因此，建議在該區域內對嗜水氣單胞菌引發的疫病首選硫酸新霉素、氟苯尼考、乳酸環丙沙星、恩諾沙星和強力霉素。

表3 30株致病性嗜水氣單胞菌對抗菌素感受性

表4 3株副溶血弧菌對抗菌素感受性

表5 3株氣味沙雷氏菌對抗菌素感受性

3株副溶血弧菌均分離于河蟹肝胰腺中，說明副溶血弧菌主要感染河蟹，通過藥物感受性結果來看，該菌對恩諾沙星、硫酸新霉素、氟苯尼考、乳酸環丙沙星、鹽酸土霉素和強力霉素都敏感，敏感率達100%。通過流行性病學調查分析，這與當地成蟹養殖過程中較少使用抗菌藥物相關聯，當地成蟹對大多數抗菌藥物有較好的敏感性。而對甲砜霉素耐藥菌株達100%，經過調查，這可能是由于當地十幾家養蟹戶曾從同一苗種場購買扣蟹，而該苗種場被調查出多次使用甲砜霉素全池潑灑漂苗有關。對紅霉素的耐藥菌株達66.7%，經調查，這些塘口都有次數不等地使用過含紅霉素成分的藍藻藥殺藍藻的經歷，造成了菌株對紅霉素產生耐藥性。

在草魚、龍蝦和螃蟹中均分離出氣味沙雷氏菌，該菌是一種廣譜菌。藥物感受性實驗得出，該菌對恩諾沙星、硫酸新霉素、乳酸環丙沙星敏感菌株達100%，對紅霉素不敏感，耐藥性達100%，其次是甲砜霉素也不敏感，耐藥菌株達66.7%。這可能與使用過含紅霉素成分的藍藻藥殺藍藻的經歷有關。

綜上所述，泗陽縣水產養殖過程中使用抗生素的現象較少，對大多說抗生素藥物均表現出較高的敏感性。