D－二聚體、胱抑素C、肌酐聯合檢測在腎病綜合征血栓形成風險評估中的臨床意義

林慧貞，黃如春，林生，梁育青

（莆田市第一醫院檢驗科，福建 莆田 351100）

腎病綜合征（Nephriticsyndrome，NS）是一組以大量蛋白尿、低蛋白血癥、高脂血癥和水腫為主的臨床癥狀，即典型的三高一低,大量蛋白尿（≥3.5g/d)和低蛋白血癥（≤30g/L)為此病的必備條件。由于腎病綜合征患者體內大量蛋白丟失和高脂血癥，常引起機體的凝血、抗凝及纖溶系統之間的失衡，從而易誘發血栓的形成。血栓及栓塞性癥狀是腎病綜合征患者的常見并發癥，其發生率為8.5%～38.0%[1-2]。本文旨在通過對D－二聚體聯合胱抑素C（Cys-C）和肌酐（Cr）等腎功能損害相關指標的檢測，觀察其對NS患者并發血栓栓塞的影響，為腎病綜合征發生血栓的預警和診斷提供臨床診斷依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取我院住院和門診收治的腎病綜合征患者62例，其中男性患者38例，女性患者24例，年齡26～78歲，平均年齡為45.3±18.6歲。并選擇同期健康體檢者80例作為對照組（排除可能影響D－二聚體和Cys-C水平的因素：急性心肌梗死、肺栓塞等栓塞性疾病、嚴重的心、腎、肝功能不全及任何抗凝藥物等），其中男45例，女35例，年齡25～77歲，平均年齡為 44.7±19.1歲，兩組的性別、年齡等資料比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

1.2 方法 空腹采集肘靜脈血2ml于3.8%枸櫞酸鈉抗凝管（抗凝劑與血比例為1：9），離心，分離留取血漿，用于D－二聚體的測定；同時取3ml靜脈血注入促凝管中,離心，分離血清，用于Cys-C和肌酐的測定。

1.3 儀器和試劑 采用德國羅氏C8000全自動生化分析儀及其原裝配套試劑檢測Cys-C(免疫比濁法)及Cr(酶法)。D－二聚體檢測采用免疫比濁法,Stago compact全自動血凝儀儀器及其原裝配套D-二聚體試劑。Cys-C參考值范圍為0.5～1.5 mg/L,Cr為 45～133 μmol/L，D-D 為 0～0.5 mg/L。

1.4 免疫熒光法檢測脂蛋白相關磷脂酶A2用4%的多聚甲醛固定組織切片15min，PBS浸洗玻片 3次，每次 3min；0.5%Triton X-100(PBS配制 )室溫通透20min（細胞膜上表達的抗原省略此步驟）；PBS浸洗玻片3次，每次3 min，吸水紙吸干PBS,在玻片上滴加正常山羊血清,室溫封閉30min；吸水紙吸掉封閉液，不洗，每張玻片滴加足夠量的稀釋好的一抗 （抗脂蛋白相關磷脂酶A2抗體）并放入濕盒，4℃孵育過夜；加熒光二抗：PBST浸洗爬片3次，每次3min，吸水紙吸干爬片上多余液體后滴加稀釋好的熒光二抗，濕盒中20～37℃孵育1h，PBST浸洗切片3次，每次3min；注意：從加熒光二抗起，后面所有操作步驟都盡量在較暗處進行。復染核：滴加DAPI避光孵育5min，對標本進行染核，PBST 5min×4次洗去多余的DAPI；用吸水紙吸干爬片上的液體,用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

1.5 統計學處理 用SPSS17.0版本的統計軟件進行處理和分析,計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，計數資料的比較采用χ2檢驗，采用Spearman相關性進行兩變量的相關性分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血清中 Cys-C、Cr、D－二聚體的檢測結果 62例腎病綜合征患者中Cys-C、Cr、D－二聚體均明顯高于對照組的水平，差異均有統計學意義。同時有21例D－二聚體大于0.5 mg/L，陽性率33.9%,見表1。

表1 各組中Cys-C、Cr、D－二聚體的檢測結果

2.2 腎病綜合征患者血清D－二聚體與Cys-C成正相關關系 r＝0.3300，P＝0.0006,見圖 1。

圖1 血清D－二聚體與Cys-C成正相關關系

2.3 D－二聚體增高的腎病綜合征患者的腎組織脂蛋白相關磷脂酶A2表達情況 21例D－二聚體增高(>0.5 mg/L)的腎病綜合征患者的腎組織中脂蛋白相關磷脂酶A2表達的陽性率為95.2%（20/21）,其他40例D－二聚體增高(<0.5 mg/L)脂蛋白相關磷脂酶A2的陽性率為17.5%（7/40）,D－二聚體增高病例組中脂蛋白相關磷脂酶A2表達的陽性率明顯高于D－二聚體正常組（P＜0.05）。見圖2。

圖2 免疫熒光檢測脂蛋白相關磷脂酶A2表達情況A：脂蛋白相關磷脂酶A2表達；B：DAPI核染

3 討論

腎病綜合征是內科常見的一種以大量蛋白尿、低白蛋白血癥、高脂血癥和高度水腫為主要臨床表現的一組臨床癥狀群。由于腎病綜合征患者大量蛋白流失導致抗凝血酶Ⅲ缺乏,高脂血癥也可以導致血液粘稠度增加，機體血流動力學改變，內皮細胞的損傷等等眾多的因素促成患者體內處于一個高凝狀態,為此易發生血栓形成及栓塞性的并發癥。靜脈血栓形成是腎病綜合征常見并發癥之一，國內外文獻報道腎病綜合征患者發生靜脈血栓栓塞的發病率為3%～69%[3-4]，可誘發下肢深靜脈血栓形成 （DVT）、 肺栓塞 （PE）、 腎靜脈血栓（RVT）或者其他部位的血栓栓塞，其中以腎靜脈血栓（RVT）最常見，下肢深靜脈血栓形成（DVT）和肺栓塞（PE）次之，冠狀血管、腦血管等一些器官也可以形成血栓，是最嚴重的并發癥之一。血栓的形成可以嚴重影響到腎病綜合征的預后,甚至危及生命。因此，早期診斷、治療和預防血栓的形成對臨床腎病綜合征患者的預后起到非常重要的作用，值得深入研究。

腎病綜合征患者血栓的形成是由多種機制參與的，國內外研究學者認為腎病綜合征易發生血栓主要有以下幾方面原因[5-6]：⑴腎病綜合征患者大量蛋白尿導致血液中的凝血因子Ⅸ、Ⅺ、Ⅻ和凝血酶原、抗凝血酶原等減少，并通過凝血系統之間的相互刺激作用引發凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅹ增加等因素使得機體處于一種高凝的狀態；⑵蛋白S、蛋白C和組織因子途徑抑制物由于機體的原因合成減少，使得機體中的抗凝功能減弱，同時又由于纖維蛋白、纖維蛋白溶酶原和組織型先溶酶原激活劑降低導致纖溶系統發生異常；⑶血漿清蛋白的丟失可代償性誘發纖維蛋白原的增加，造成腎病綜合征患者高纖維蛋白原血癥，從而促進血小板的聚合能力，引發血液粘度增加，并誘發血流動力學改變，促使患者體內處于高凝集狀態；⑷抗凝血酶（AT）Ⅲ由于相對分子質量極小，其有可能隨著患者大量蛋白尿丟失，血管內凝血作用增強使得AT加速消耗，從而無法抑制凝血酶作用。D－二聚體是臨床上常用于反應機體內高凝和繼發纖溶狀態的一種指標，D－二聚體的升高表明機體血管內有活化的血栓形成及纖維溶解動作，因D－二聚體是由纖維蛋白單體經活化因子交聯后，由纖溶酶水解而產生的降解產物，它主要反映纖維蛋白溶解功能[7-8]。Cys-C是由機體有核細胞產生的一種半胱氨酸蛋白酶抑制劑，在各種組織的有核細胞和體液中廣泛存在，且其產生率恒定。血清Cys-C是目前反映腎小球濾過率變化最為理想的內源性標志物，由于人體血液循環中的Cys-C僅經腎小球濾過而被清除，并在近曲小管被重吸收，但重吸收后被完全代謝分解，不返回血液，是一種能靈敏反映腎小球濾過率變化的內源性標志物，是評估腎功能損害的較好指標，Cys-C值越高，腎功能損害越嚴重[9-10]。

評估腎病綜合征的體內是否處于高凝狀態和腎功能的損害情況是目前臨床治療腎病綜合征關注的兩大問題。腎病綜合征狀態下由于大量的蛋白流失，體內抗凝物質會發生改變，誘發凝血系統、抗凝系統和抗纖溶系統之間的失衡，血流動力學的改變等等常常導致腎病綜合征患者體內處于一種高凝狀態。本研究結果顯示，62例腎病綜合征患者中有21例D－二聚體大于0.5 mg/L，陽性率為33.9%，同時患者血漿中D－二聚體的水平為(0.87±0.46 mg/L)明顯高于對照組的水平 （0.38±0.16mg/L)，差異有統計學意義（t=5.34,P=0.017） ,血漿中D－二聚體的增加表明腎病綜合征患者體內雙重激活了纖溶系統和凝血系統，有形成血栓的跡象，應引起重視[11-13]。本文數據還顯示62例腎病綜合征患者中 Cys-C （4.37±1.42 mg/L）、Cr的水平均明顯高于對照組的水平，差異均有統計學意義，表明腎病綜合征患者有不同程度的腎功能損傷。同時數據結果顯示D－二聚體與Cys-C呈正相關性，與Cr相關性不明顯，證實了D－二聚體、Cys-C與血栓栓塞的發生、發展存在一定關系，而肌酐可能與血栓形成的關系不太大。腎病綜合征患者存在活化的血栓形成和纖溶亢進，有血栓栓塞風險，且這種風險隨著腎功能損害程度的增高而增大,近年來許多學者研究發現Cys-C與心血管疾病之間有一定關系，因Cys-C是半胱氨酸蛋白酶抑制劑家族成員之一，能激活中性粒細胞，參與炎癥反應過程，可損傷內皮細胞進而使一氧化氮（NO）產生減少,同時還可調節半胱氨酸蛋白酶的活性，參與調節細胞外基質的產生與降解的動態平衡，通過炎癥反應從而改變凝血因子的功能參與血栓形成[14-15]。

脂蛋白相關磷脂酶A2是一種新的炎癥酶，主要由巨噬細胞、淋巴細胞等炎癥細胞分泌，主要參與磷脂重建及生物膜的穩定。腎病綜合征合并血栓患者高表達脂蛋白相關磷脂酶 A2，而脂蛋白相關磷脂酶 A2能水解氧化型LDL,產生溶血卵磷脂和氧化型游離脂肪酸，易導致血栓形成。

綜上所述，如何有效的診斷、治療及預防血栓形成對于腎病綜合征患者的預后起著極其重要的作用,Cys-C和D－二聚體檢測結果既可作為判斷高凝及纖溶亢進狀態也可以用于評估腎病綜合征患者血栓形成風險和腎臟損害程度指標，Cys-C和D－二聚體可用于臨床腎病綜合征患者血栓形成的預測檢驗因子。