血清miR-26a/b 對原發性胃癌的診斷效果研究

李延領

(濟源市人民醫院消化科，河南 濟源 454600)

隨著社會節奏加快以及生活方式的轉變，胃癌已經成為影響全人類生命與生活質量不容忽視的疾病,有研究報道目前胃癌發病率已經居世界腫瘤疾病第4位，死亡率居第2位[1]。胃癌不僅發病率高，惡性程度也相當高，患者的生命質量受到極其嚴重的威脅,尤其是中晚期胃癌患者往往因為病情惡化喪失了治療的機會。因此提高胃癌患者的生命質量,提高胃癌的診斷率具有重要的臨床意義[2]。目前胃鏡檢查聯合粘膜活檢是較為常用的胃癌診斷方式,而以分子標志物進行檢查是近年來廣泛應用且診斷率較高的檢查方式,對于胃癌的診斷主要依賴于CEA、CA19-9、CA72-4等分子標志物，但以上標志物往往在中期或晚期胃癌中具有較好的診斷價值，在早期胃癌的診斷中作用尚不明顯，因此為提高胃癌的早期診斷率研究新的標志物具有重要意義[3-4]。微小RNA（miRNA）是廣泛存在于真核生物中的小型非編碼RNA,是一類能夠影響基因表達的調節分子。目前臨床發現miRNA與包括乳腺癌、肺癌、前列腺癌、肝癌以及胃癌等多種惡性腫瘤疾病的發病有一定的相關性,其對靶基因表達的調節作用能夠影響癌細胞的增殖分化、遷移侵襲等多個方面[5-6]。為提高原發性胃癌早期診斷率,現以血清miR-26a與miR-26b為診斷標志物,探究此兩種標志物在原發性胃癌患者中的表達情況,從而進一步探究其對原發性胃癌的診斷價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年5月至2018年1月于我院接受治療的102例原發性胃癌患者、39例入院治療的非腫瘤性胃病患者以及同期入院體檢的89例健康個體為研究對象，其中：

觀察組：102例胃癌患者為觀察組，患者年齡39~58歲,平均年齡44.68±7.72歲,其中男性患者67例,女性患者35例。

疾病對照組：39例非腫瘤性胃病患者為疾病對照組，患者年齡32~69歲,平均年齡44.29±8.04歲,其中男性患者20例,女性患者19例。

對照組：89例健康個體為對照組,個體年齡34-62歲，平均年齡45.43±8.86歲，其中男性個體61例，女性個體28例。

各組患者年齡及性別比較差異無統計學意義P>0.05。所有患者均符合以下納入標準：⑴符合原發性胃癌的臨床診斷標準[7]⑵除胃癌外無其他腫瘤疾病⑶無糖尿病、高血壓等內科疾病⑷預計生存期≥3個月⑸患者及家屬均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 血樣采集 提前一天通知所有患者第二天進行血樣采集,患者空腹條件下抽取靜脈血5ml,低溫保存于促凝管中。待所有血樣收集完畢后以3000r/min離心15min,取離心后上層清液于不含RNA酶的1.5ml離心管中。血清置于-80℃環境下保存。

1.2.2 胃癌組織采集 收集胃癌患者手術切除的胃癌組織以及距離腫瘤邊緣5cm以上的正常組織,共取標本102對。手術切除獲得的新鮮胃癌組織標本置于液氮中冷凍保存。

1.2.3 mi-RNA提取與qRT-PCR檢測 根據TRI-zol操作標準提取血清樣本中的mi-RNA,使用紫外分光光度計對RNA質量與濃度進行測定。提取2μLRNA進行逆轉錄操作，根據逆轉錄酶及其產品說明書，在 16℃15min、42℃1h、85℃5min的條件下進行逆轉錄操作,操作完畢獲取的cDNA置于-20℃環境下保存。qRT-PCR檢測使用探針法，在95℃5min、95℃15s、60℃1min 的反應條件下進行操作，最后兩步反應條件共40個循環。以管家基因U6snRNA表達量為內參值,以熒光信號達到設定閾值時PCR經歷的循環數為Ct值。

1.3 評價指標 比較兩組患者血清中miR-26a與miR-26b的表達量；比較觀察組患者不同胃癌病理特征的miR-26a與miR-26b的表達量；使用logistics多因素回歸分析血清miR-26a與miR-26b的表達量與原發性胃癌之間的相關性。

1.4 統計學方法 采用SPSS19.0軟件對研究中得到數據進行統計學分析。計量資料的兩組比較采用t檢驗，多組比較為方差分析。計數資料比較用χ2檢驗。有統計學意義的相關因素行多因素Logistic回歸分析。診斷價值評價行ROC分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者miR-26a與miR-26b表達量比較整體比較知：各指標整體差異有統計學意義 （P＜0.05）。多重比較并結合主要數據分析：觀察組患者血清miR-26a表達量為 1.60±1.02、miR-26b表達量為1.40±0.68,低于疾病對照組與對照組,差異均具有統計學意義P<0.05。見表1。

表1 兩組患者miR-26a與miR-26b表達量比較

2.2 觀察組不同病理特征患者miR-26a與miR-26b表達量比較 觀察組不同胃癌病理特征患者的miR-26a與miR-26b的表達量比較發現,有淋巴結轉移的患者miR-26a與miR-26b表達量低于無淋巴結轉移的患者，差異具有統計學意義(P<0.05)。病理分期Ⅳ期患者miR-26a與miR-26b表達量低于Ⅲ期、Ⅱ期以及Ⅰ期患者，且病理分期越高miR-26a與miR-26b表達量越低，差異具有統計學意義(P<0.05)。 見表 2。

2.3 logistics多因素回歸分析 以本研究觀察組和疾病對照組資料為樣本。是否原發性胃癌為應變量，賦值1=是（觀察組），0=否（疾病對照組）。以miR-26a與miR-26b表達量為自變量,并分別按該二表達量的兩組總均值（取整后分別為2.6和2.4）進行兩分類轉化，賦值1≤總均值，0≥總均值。建立非條件logistics多因素回歸模型。分析顯示：miR-26a與miR-26b表達量與原發性胃癌發病之間有明顯的關聯性，miR-26a表達量與原發性胃癌發病的OR值為1.442、P值為 0.004，miR-26b表達量與原發性胃癌發病的 OR值為 2.942、P=0.009。見表3。

2.4 miR-26a與miR-26b表達對診斷原發性胃癌的價值分析 采用ROC分析進行了miR-26a與miR-26b表達對原發性胃癌的診斷價值分析。仍以觀察組和疾病對照組資料為樣本，并適當劃分該二指標數據/表達水平為7~8個組段，建立ROC分析模型。結果：該二指標的ROC-AUC均在0.75以上，敏感度和特異性都在0.7附近，提示有較高的原發性胃癌診斷價值。見表4。ROC曲線見圖1。

3 討論

惡性腫瘤疾病的早期診斷是臨床人們非常關注的問題,近年來血清腫瘤標志物的廣泛應用大大提高了惡心腫瘤的早期檢出率,使部分腫瘤患者的生存質量得到極大的提高。但是對于原發性胃癌目前卻沒有非常有效的檢查途徑,臨床使用較多的CEA、CA72-4、CA19-9在胃癌的檢測中特異性并不強，因此如何提高胃癌的早期診斷率逐漸成為臨床重點關注的問題[8-9]。近年來miRNAs被發現具有調控細胞凋亡的作用，mRNAs是一類含有21-23個核苷酸的小型內源性非編碼RNA，能夠在轉錄后調節基因的表達[10-11]。研究表明miRNA是細胞分化凋亡以及影響信號通路的主要調控因子，且有研究認為其在癌癥的診斷中具有一定的價

值，為進一步探究miRNA在腫瘤疾病尤其是胃癌中的作用,現開展血清miR-26a與miR-26b對原發性胃癌的診斷效果研究。

表2 觀察組不同病理特征患者miR-26a與miR-26b表達量比較

表3 logistics多因素回歸分析結果

表4 ROC分析結果

圖1 ROC曲線

研究結果顯示,胃癌患者血清miR-26a與miR-26b表達量明顯低于正常個體，且兩組數據比較差異具有統計學意義(P＜0.05)。此結果提示miR-26a與miR-26b的表達的確與胃癌發病具有非常密切的關聯性,如果臨床檢測患者miR-26a與miR-26b表達量較低,且出現胃癌相關的臨床病癥，則有理由認為患者發生胃癌的可能性較高。進一步探究miR-26a與miR-26b與胃癌發病程度的關系,本研究對不同病理特征的胃癌患者胃癌組織額miR-26a與miR-26b進行比較,研究發現出現淋巴結轉移的患者miR-26a與miR-26b表達水平明顯低于未出現淋巴結轉移的患者,這就意味著在已經診斷出胃癌的患者中，miR-26a與miR-26b表達水平越低則患者的病情有可能越嚴重[12-13]。病理分期結果顯示Ⅳ期患者miR-26a與miR-26b表達量遠遠低于前三期患者,且病理分期越靠后，miR-26a與miR-26b表達量越低,此結果與淋巴結轉移結果可一同為診斷患者胃癌進展程度提供依據。

無論是胃癌患者與正常個體比較,還是不同病理特征的胃癌患者組內比較，研究都發現miR-26a與miR-26b與胃癌之間有明顯相關性。為進一步理清二者的關系進行回歸分析，logistics多因素回歸分析顯示miR-26a與miR-26b與胃癌發病之間確有相關性,當miR-26a與miR-26b表達較低時提示患者有發生胃癌的風險[14-15]。

本研究進一步做了miR-26a與miR-26b對胃癌發病診斷預測的價值研究。ROC分析發現：該二指標的 ROC-AUC 均在 0.75以上（P＜0.05），敏感度和特異性都在0.7附近，提示有較高的原發性胃癌診斷價值。即如前分析一致：若早期檢測miR-26a與miR-26b水平在理論閾值 （分別為2.64和2.41）以下，則胃癌發病的可能性將大大增加。

綜上所述,血清miR-26a與miR-26b表達量與原發性胃癌之間有顯著相關性,胃癌患者miR-26a與miR-26b表達量處于較低水平,且病理特征表現越嚴重，miR-26a與miR-26b表達量越低，具有良好的臨床診斷價值。