結核感染T細胞檢測(TB-IGRA)在不典型肺結核診斷中的應用

吳麗華，鄒細平

(萍鄉市第三人民醫院，江西 萍鄉337000)

肺結核是由結核分枝桿菌感染引起的一類呼吸系統慢性傳染病，是目前全球最嚴重，造成死亡人數最多的單一傳染性疾病[1]。我國是全球結核病高負擔國家之一,根據2010年全國第5次結核病流行病學調查顯示[2],我國現有活動性結核患者52 3萬,占全球發病的14.3%。隨著環境污染的加重、抗生素的使用、免疫缺陷患者的增加和近年來免疫抑制劑和激素的廣泛應用等原因,使部分人群患肺結核可在癥狀、體征、和胸部X片表現及臨床經過等各方面與一般肺結核患者有許多不同特點，即所謂“不典型肺結核”。不典型肺結核占肺結核發病總數的25%左右[3]，且無癥狀肺結核患者的比例逐漸增加,而傳統的實驗室診斷方法陽性檢出率低[4-5],易造成臨床誤診漏診。因此，探索一種敏感度高、特異性好的檢測方法對于結核病的早發現、早診斷、早治療尤為重要。

結核感染T細胞檢測(TB-IGRA)是一種新的診斷結核病的細胞學檢測技術,人體感染結核分枝桿菌后，能產生特異性T淋巴細胞，并存在于外周血中，外周血中的特異性T淋巴細胞再次接觸到結核抗原后被激活，并分泌γ-干擾素.IGRAs采用結核分枝桿菌特異重組抗原在體外對待檢者的全血或外周血單個核細胞進行特異型刺激,再通過體外特異性免疫應答水平的定量分析來判斷受檢者結核分枝桿菌感染情況。目前體外特異性免疫應答水平的定量分析方法包括通過ELISA試驗（TBIGRA）定量檢測全血中γ-干擾素水平和通過ELISPOT（酶聯免疫斑點法）對體外特異性免疫應答的T淋巴細胞進行計數來定量分析。兩者相比較，TB-IGRA在操作簡便性和檢測靈活性上更具有優勢,更適用于臨床使用[6]。本研究通過對本院就診患者中疑似或待排肺結核患者65人分別使用結核抗體檢測（TB-DOT）、結核菌素試驗(PPD)和結核感染T細胞（TB-IGRA）檢測并評價各檢測項目敏感性和特異性，現報告如下：

1 材料和方法

1.1 一般資料 研究對象為2017年1月-2018年3月在我院就診患者中疑似或待排肺結核患者65例,其中男性38例、女性27例。根據肺結核診斷標準（WS288-2008）最終確診 42例（設為觀察組），其中男性25例,女性17例,平均年齡49.29±17.41歲；排除肺結核23例（對照組）,其中男性13例,女性10例,平均年齡48.43±13.33歲。兩組間性別、年齡等資料比較差異無統計學意義（P＞0.05）,具有可比性。

1.2 納入研究對象標準 ⑴痰涂片找結核菌陰性，胸部X片檢查提示疑為肺結核；⑵痰涂片找結核菌陰性，胸部X片檢查提示肺部陰影，有咳嗽、咳痰、低燒等不典型癥狀。排除標準：⑴嚴重心血管疾病患者；⑵急性傳染病患者；⑶肺結核病史等影響因素。

1.3 儀器和試劑 上海科華ST-360酶標儀;上海奧普生物醫藥有限公司生產的金標數碼定量分析儀；結核感染T細胞檢測（體外釋放酶聯免疫吸附法）試劑盒由北京萬泰生物公司生產；卡介菌純蛋白衍生物（BCG-PPD）由成都生物制品研究所有限責任公司生產;結核分枝桿菌抗體試劑由上海奧普生物醫藥有限公司生產；肝素抗凝管由美國BD公司生產。

1.4 方法 入選患者分別在早晨同時采集空腹血液標本,進行肝素抗凝外周靜脈血結核感染T細胞檢測（TB-IGRA）、血清結核抗體檢測（TB-DOT）并進行結核菌素試驗(PPD)。

1.4.1 外周血結核T細胞檢測 ⑴IFN-γ的體外釋放：①采用靜脈穿刺使用無內毒素肝素抗凝真空采血管采集不少于4ml靜脈全血；②2h內將全血標本輕柔顛倒混勻3~5次后分裝到N（本底對照管）、T（測試管）、P（陽性對照管）三種培養管中,1ml/管。③培養：將培養管輕柔顛倒混勻5次后迅速置入37℃培養22±2h，培養過程中需保持培養管直立。④離心：培養后的培養管以3000~5000r/min離心10min，取血漿進行ELISA檢測，注意不可吸到細胞層。⑵IFN-γ的定量檢測：采用ELISA法,以校準 品 （12.5pg/ml、25pg/ml、50pg/ml、100pg/ml、200 pg/ml、400pg/ml）的抗原含量及其對應的吸光度值制作標準曲線，求出線性回歸方程，將N、T、P三種培養管測得的吸光度值分別代入回歸方程，求得三種培養管血漿IFN-γ含量。⑶IFN-γ的陽性判定：按照試劑盒說明書進行,以T管與N管含量差值即（T-N）≥14,并且≥N/4,結果判定為陽性。

1.4.2 結核菌素試驗 以PPD試劑0.1ml（5IU）于左前臂內側中上1/3處皮內注射，經48~72h后觀察注射部位硬結平均直徑[（橫徑+縱徑）/2]，硬結＜5mm為陰性，5~9mm為弱陽性，10~19mm為陽性,≥20mm（或＜20mm但有水皰或壞死時）為強陽性。本研究將硬結≥5mm（或出現水皰或壞死時）均視為陽性。

1.4.3 結核抗體檢測 使用新鮮血清采用斑點免疫膠體金滲濾技術,對結核分枝桿菌特異性膜蛋白抗原進行分離純化,再在硝酸纖維素膜上點樣并固化,膜上的結核抗原會和人血清中的結核分枝桿菌抗體進行結合，再用葡萄球菌A蛋白（SPA）膠體金綴合物和結合之后的結核IgG抗體成色呈色，通過金標數碼定量分析儀進行結果判定。

1.5 統計學方法 采用SPSS17.0軟件包進行數據處理與統計分析，計量資料以均數±標準差()表示，組間比較采用t檢驗；計數資料以頻數和百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 通過對非典型肺結核組（觀察組）與非肺結核組（對照組）一般資料和癥狀體征比較，兩組研究對象在發熱和盜汗癥狀人數比較時差異有統計學意義(P＜0.05)。 見表 1。

表1 觀察組與對照組一般資料和癥狀體征比較

2.2 非典型肺結核組（觀察組）與非肺結核組（對照組）外周血TB-IGRA檢測、血清TB-DOT檢測和PPD試驗陽性率結果比較 兩組外周血TB-IGRA檢測、血清TB-DOT檢測和PPD試驗結果差異有統計學意義(χ2=52.715、9.611、6.460,P=0.000、0.002、0.011)。外周血TB-IGRA檢測在非典型肺結核患者診斷中有重要價值,Kappa值為0.900＞0.4。見表2。

2.3 TB-IGRA、TB-DOT、PPD對非典型肺結核的診斷效能比較 血清TB-IGRA檢測的靈敏度、特異度、陽性預期值、陰性預期值和符合率均顯著高于血清TB-DOT檢測和皮膚PPD試驗,各組間比較差異有統計學意義(χ2=13.650、8.178、7.536、10.9 77、18.720，P=0.001、0.017、0.023、0.004、0.000)。 見表3。

表2 非典型肺結核組（觀察組）與非肺結核組（對照組）結果比較[%（n/n）]

表 3TB-IGRA、TB-DOT、PPD 對非典型肺結核的診斷效能比較（%）

3 討論

不典型肺結核是發病年齡和部位、臨床癥狀和體征、實驗室檢查及影像學表現等與常規規律變化不一致的結核[7],因此極易忽視對患者進一步檢查診斷,從而造成臨床誤診漏診和結核病的傳播。如果能夠盡早明確診斷，及時規范治療后多數患者可以治愈,因此結核病的早期診斷和有效治療有賴于盡早明確患者是否存在結核菌。傳統的檢測如涂片染色鏡檢操作簡單,發出報告時間短，但檢出率低，同時，涂片檢出不能分辨活菌、死菌且多種抗酸桿菌均著色,需進一步試驗才能確診;結核菌培養可以通過觀察細菌生長情況并進一步進行菌種鑒定和藥敏試驗,為臨床合理用藥和有效治療提供依據，但時間較長，不能滿足臨床及時診斷和治療需求,而PCR法又存在污染風險較高的問題[8]。因此，開發特異、敏感、快速、簡單的結核病感染的診斷方法已經成為全球的共識[9]。

本研究通過對非典型肺結核組（觀察組）與非肺結核組（對照組）分別進行外周血TB-IGRA檢測、血清TB-DOT檢測和皮膚PPD試驗,從結果比較可以看出,觀察組的陽性率分別為95.2%、61.9%、71.4%,對照組的陽性率分別為4.34%、21.7%、39.1%,兩組外周血TB-IGRA檢測、血清TB-D OT檢測和PPD試驗結果差異有統計學意義 （χ2=52.715、9.611、6.460,P=0.000、0.002、0.011）。外周血TB-IGRA檢測、血清TB-DOT檢測 、PPD試驗在觀察組的靈敏度、特異度、陽性預期值、陰性預期值和＜符合率均顯著高于血清TB-DOT檢測和皮膚PPD試驗,各組間比較差異有統計學意義 （χ2=13.650、8.178、7.536、10.977、18.720,P=0.001、0.017、0.023、0.004、0.000）。 血清結核抗體檢測操作簡單快速，但存在假陽性和假陰性的問題。本研究中觀察組和對照組血清結核抗體的檢測差異有統計學意義，診斷符合率為67.7%，Kappa值為0.362＜0.4，說明血清結核抗體與非典型肺結核診斷一致性較差，在相關研究[10-12]中的結核抗體陽性率為30.8%~73.3%。存在較大的變異，所以，2011年WHO建議不再使用結核抗體檢測結核感染。PPD試驗至今仍廣泛使用。但該方法在卡介苗疫苗接種或非結核接觸者易出現假陽性,同時在一些特殊人群如HIV感染、全身性感染等人群中易造成假陰性[13],本研究中PPD試驗的在非典型肺結核的診斷效能高于血清結核抗體,但價值有限（Kappa值＜0.4）。而TB-IGRA是一種新的用于結核桿菌感染的體外免疫診斷方法，TB-IGRA通過選取存在于結核桿菌,但在卡介苗和大多數非結核桿菌中普遍缺失的RD1區編碼的ESAT-6和CFP-10作為結核桿菌特異性抗原,與新鮮采取的肝素鈉抗凝全血或者PBMC(外周血單個核細胞)充分混合孵育后,應用酶聯免疫法或者免疫斑點法檢測特異性γ-干擾素的釋放。結果不受卡介苗干擾，提高了結果的特異性。從本結果看TB-IGRA在診斷非典型肺結核的敏感度、特異度明顯高于血清結核抗體檢測和結核菌素試驗,分別為95.2%、95.7%,與黃其俊等[14-15]結果一致,在結核病診斷中具有重要價值和明顯優勢。

在全球所有傳染性疾病中,結核病已成為成年人的首要死亡原因[16]。根據世界衛生組織統計數據顯示，我國是全球22個結核病流行嚴重的國家之一,被WHO列為結核病高負擔、高危險性國家之一[17]。通過酶免法檢測外周血中結核感染后特異性細胞因子γ-干擾素來診斷是否存在結核感染已被列入英美等發達國家的臨床診治指南[18]，同時，已獲國家衛計委批準并在2018年5月1日實施的肺結核診斷標準WS288-2017中增加了將γ-干擾素釋放試驗用于結核病的輔助診斷。但由于TBIGRA價格昂貴，在一定程度上限制了此項目的推廣應用，另外一方面，TB-IGRA作為結核感染的輔助診斷方法，不能有效區分LTBI和活動性TB，也不能準確預測LTBI發展為活動性結核的風險，同時也不推薦以IGRAs代替PPD試驗用于健康人群公共衛生干預中的篩查手段[19]，所以，對結核的診斷、治療和預防工作任重道遠，相信未來可發現更為特異的結核抗原作為刺激原,不斷提高結核的早期診斷和治療水平,有效控制并降低結核病的發生率和死亡率。

綜上所述,結核感染T細胞檢測在非典型性肺結核的診斷中具有重要價值，同時，全面細致的觀察是正確診斷的基礎,并及時提出進一步檢查的意見，減少誤診率的發生。