結(jié)核感染T細(xì)胞檢測(cè)(TB-IGRA)在不典型肺結(jié)核診斷中的應(yīng)用

吳麗華，鄒細(xì)平

(萍鄉(xiāng)市第三人民醫(yī)院，江西 萍鄉(xiāng)337000)

肺結(jié)核是由結(jié)核分枝桿菌感染引起的一類呼吸系統(tǒng)慢性傳染病，是目前全球最嚴(yán)重，造成死亡人數(shù)最多的單一傳染性疾病[1]。我國(guó)是全球結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一,根據(jù)2010年全國(guó)第5次結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查顯示[2],我國(guó)現(xiàn)有活動(dòng)性結(jié)核患者52 3萬,占全球發(fā)病的14.3%。隨著環(huán)境污染的加重、抗生素的使用、免疫缺陷患者的增加和近年來免疫抑制劑和激素的廣泛應(yīng)用等原因,使部分人群患肺結(jié)核可在癥狀、體征、和胸部X片表現(xiàn)及臨床經(jīng)過等各方面與一般肺結(jié)核患者有許多不同特點(diǎn)，即所謂“不典型肺結(jié)核”。不典型肺結(jié)核占肺結(jié)核發(fā)病總數(shù)的25%左右[3]，且無癥狀肺結(jié)核患者的比例逐漸增加,而傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室診斷方法陽(yáng)性檢出率低[4-5],易造成臨床誤診漏診。因此，探索一種敏感度高、特異性好的檢測(cè)方法對(duì)于結(jié)核病的早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療尤為重要。

結(jié)核感染T細(xì)胞檢測(cè)(TB-IGRA)是一種新的診斷結(jié)核病的細(xì)胞學(xué)檢測(cè)技術(shù),人體感染結(jié)核分枝桿菌后，能產(chǎn)生特異性T淋巴細(xì)胞，并存在于外周血中，外周血中的特異性T淋巴細(xì)胞再次接觸到結(jié)核抗原后被激活，并分泌γ-干擾素.IGRAs采用結(jié)核分枝桿菌特異重組抗原在體外對(duì)待檢者的全血或外周血單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行特異型刺激,再通過體外特異性免疫應(yīng)答水平的定量分析來判斷受檢者結(jié)核分枝桿菌感染情況。目前體外特異性免疫應(yīng)答水平的定量分析方法包括通過ELISA試驗(yàn)（TBIGRA）定量檢測(cè)全血中γ-干擾素水平和通過ELISPOT（酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法）對(duì)體外特異性免疫應(yīng)答的T淋巴細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)來定量分析。兩者相比較，TB-IGRA在操作簡(jiǎn)便性和檢測(cè)靈活性上更具有優(yōu)勢(shì),更適用于臨床使用[6]。本研究通過對(duì)本院就診患者中疑似或待排肺結(jié)核患者65人分別使用結(jié)核抗體檢測(cè)（TB-DOT）、結(jié)核菌素試驗(yàn)(PPD)和結(jié)核感染T細(xì)胞（TB-IGRA）檢測(cè)并評(píng)價(jià)各檢測(cè)項(xiàng)目敏感性和特異性，現(xiàn)報(bào)告如下：

1 材料和方法

1.1 一般資料 研究對(duì)象為2017年1月-2018年3月在我院就診患者中疑似或待排肺結(jié)核患者65例,其中男性38例、女性27例。根據(jù)肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)（WS288-2008）最終確診 42例（設(shè)為觀察組），其中男性25例,女性17例,平均年齡49.29±17.41歲；排除肺結(jié)核23例（對(duì)照組）,其中男性13例,女性10例,平均年齡48.43±13.33歲。兩組間性別、年齡等資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）,具有可比性。

1.2 納入研究對(duì)象標(biāo)準(zhǔn) ⑴痰涂片找結(jié)核菌陰性，胸部X片檢查提示疑為肺結(jié)核；⑵痰涂片找結(jié)核菌陰性，胸部X片檢查提示肺部陰影，有咳嗽、咳痰、低燒等不典型癥狀。排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴嚴(yán)重心血管疾病患者；⑵急性傳染病患者；⑶肺結(jié)核病史等影響因素。

1.3 儀器和試劑 上海科華ST-360酶標(biāo)儀;上海奧普生物醫(yī)藥有限公司生產(chǎn)的金標(biāo)數(shù)碼定量分析儀；結(jié)核感染T細(xì)胞檢測(cè)（體外釋放酶聯(lián)免疫吸附法）試劑盒由北京萬泰生物公司生產(chǎn)；卡介菌純蛋白衍生物（BCG-PPD）由成都生物制品研究所有限責(zé)任公司生產(chǎn);結(jié)核分枝桿菌抗體試劑由上海奧普生物醫(yī)藥有限公司生產(chǎn)；肝素抗凝管由美國(guó)BD公司生產(chǎn)。

1.4 方法 入選患者分別在早晨同時(shí)采集空腹血液標(biāo)本,進(jìn)行肝素抗凝外周靜脈血結(jié)核感染T細(xì)胞檢測(cè)（TB-IGRA）、血清結(jié)核抗體檢測(cè)（TB-DOT）并進(jìn)行結(jié)核菌素試驗(yàn)(PPD)。

1.4.1 外周血結(jié)核T細(xì)胞檢測(cè) ⑴IFN-γ的體外釋放：①采用靜脈穿刺使用無內(nèi)毒素肝素抗凝真空采血管采集不少于4ml靜脈全血；②2h內(nèi)將全血標(biāo)本輕柔顛倒混勻3~5次后分裝到N（本底對(duì)照管）、T（測(cè)試管）、P（陽(yáng)性對(duì)照管）三種培養(yǎng)管中,1ml/管。③培養(yǎng)：將培養(yǎng)管輕柔顛倒混勻5次后迅速置入37℃培養(yǎng)22±2h，培養(yǎng)過程中需保持培養(yǎng)管直立。④離心：培養(yǎng)后的培養(yǎng)管以3000~5000r/min離心10min，取血漿進(jìn)行ELISA檢測(cè)，注意不可吸到細(xì)胞層。⑵IFN-γ的定量檢測(cè)：采用ELISA法,以校準(zhǔn) 品 （12.5pg/ml、25pg/ml、50pg/ml、100pg/ml、200 pg/ml、400pg/ml）的抗原含量及其對(duì)應(yīng)的吸光度值制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出線性回歸方程，將N、T、P三種培養(yǎng)管測(cè)得的吸光度值分別代入回歸方程，求得三種培養(yǎng)管血漿IFN-γ含量。⑶IFN-γ的陽(yáng)性判定：按照試劑盒說明書進(jìn)行,以T管與N管含量差值即（T-N）≥14,并且≥N/4,結(jié)果判定為陽(yáng)性。

1.4.2 結(jié)核菌素試驗(yàn) 以PPD試劑0.1ml（5IU）于左前臂內(nèi)側(cè)中上1/3處皮內(nèi)注射，經(jīng)48~72h后觀察注射部位硬結(jié)平均直徑[（橫徑+縱徑）/2]，硬結(jié)＜5mm為陰性，5~9mm為弱陽(yáng)性，10~19mm為陽(yáng)性,≥20mm（或＜20mm但有水皰或壞死時(shí)）為強(qiáng)陽(yáng)性。本研究將硬結(jié)≥5mm（或出現(xiàn)水皰或壞死時(shí)）均視為陽(yáng)性。

1.4.3 結(jié)核抗體檢測(cè) 使用新鮮血清采用斑點(diǎn)免疫膠體金滲濾技術(shù),對(duì)結(jié)核分枝桿菌特異性膜蛋白抗原進(jìn)行分離純化,再在硝酸纖維素膜上點(diǎn)樣并固化,膜上的結(jié)核抗原會(huì)和人血清中的結(jié)核分枝桿菌抗體進(jìn)行結(jié)合，再用葡萄球菌A蛋白（SPA）膠體金綴合物和結(jié)合之后的結(jié)核IgG抗體成色呈色，通過金標(biāo)數(shù)碼定量分析儀進(jìn)行結(jié)果判定。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)和百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 通過對(duì)非典型肺結(jié)核組（觀察組）與非肺結(jié)核組（對(duì)照組）一般資料和癥狀體征比較，兩組研究對(duì)象在發(fā)熱和盜汗癥狀人數(shù)比較時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。 見表 1。

表1 觀察組與對(duì)照組一般資料和癥狀體征比較

2.2 非典型肺結(jié)核組（觀察組）與非肺結(jié)核組（對(duì)照組）外周血TB-IGRA檢測(cè)、血清TB-DOT檢測(cè)和PPD試驗(yàn)陽(yáng)性率結(jié)果比較 兩組外周血TB-IGRA檢測(cè)、血清TB-DOT檢測(cè)和PPD試驗(yàn)結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=52.715、9.611、6.460,P=0.000、0.002、0.011)。外周血TB-IGRA檢測(cè)在非典型肺結(jié)核患者診斷中有重要價(jià)值,Kappa值為0.900＞0.4。見表2。

2.3 TB-IGRA、TB-DOT、PPD對(duì)非典型肺結(jié)核的診斷效能比較 血清TB-IGRA檢測(cè)的靈敏度、特異度、陽(yáng)性預(yù)期值、陰性預(yù)期值和符合率均顯著高于血清TB-DOT檢測(cè)和皮膚PPD試驗(yàn),各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=13.650、8.178、7.536、10.9 77、18.720，P=0.001、0.017、0.023、0.004、0.000)。 見表3。

表2 非典型肺結(jié)核組（觀察組）與非肺結(jié)核組（對(duì)照組）結(jié)果比較[%（n/n）]

表 3TB-IGRA、TB-DOT、PPD 對(duì)非典型肺結(jié)核的診斷效能比較（%）

3 討論

不典型肺結(jié)核是發(fā)病年齡和部位、臨床癥狀和體征、實(shí)驗(yàn)室檢查及影像學(xué)表現(xiàn)等與常規(guī)規(guī)律變化不一致的結(jié)核[7],因此極易忽視對(duì)患者進(jìn)一步檢查診斷,從而造成臨床誤診漏診和結(jié)核病的傳播。如果能夠盡早明確診斷，及時(shí)規(guī)范治療后多數(shù)患者可以治愈,因此結(jié)核病的早期診斷和有效治療有賴于盡早明確患者是否存在結(jié)核菌。傳統(tǒng)的檢測(cè)如涂片染色鏡檢操作簡(jiǎn)單,發(fā)出報(bào)告時(shí)間短，但檢出率低，同時(shí)，涂片檢出不能分辨活菌、死菌且多種抗酸桿菌均著色,需進(jìn)一步試驗(yàn)才能確診;結(jié)核菌培養(yǎng)可以通過觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況并進(jìn)一步進(jìn)行菌種鑒定和藥敏試驗(yàn),為臨床合理用藥和有效治療提供依據(jù)，但時(shí)間較長(zhǎng)，不能滿足臨床及時(shí)診斷和治療需求,而PCR法又存在污染風(fēng)險(xiǎn)較高的問題[8]。因此，開發(fā)特異、敏感、快速、簡(jiǎn)單的結(jié)核病感染的診斷方法已經(jīng)成為全球的共識(shí)[9]。

本研究通過對(duì)非典型肺結(jié)核組（觀察組）與非肺結(jié)核組（對(duì)照組）分別進(jìn)行外周血TB-IGRA檢測(cè)、血清TB-DOT檢測(cè)和皮膚PPD試驗(yàn),從結(jié)果比較可以看出,觀察組的陽(yáng)性率分別為95.2%、61.9%、71.4%,對(duì)照組的陽(yáng)性率分別為4.34%、21.7%、39.1%,兩組外周血TB-IGRA檢測(cè)、血清TB-D OT檢測(cè)和PPD試驗(yàn)結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （χ2=52.715、9.611、6.460,P=0.000、0.002、0.011）。外周血TB-IGRA檢測(cè)、血清TB-DOT檢測(cè) 、PPD試驗(yàn)在觀察組的靈敏度、特異度、陽(yáng)性預(yù)期值、陰性預(yù)期值和＜符合率均顯著高于血清TB-DOT檢測(cè)和皮膚PPD試驗(yàn),各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （χ2=13.650、8.178、7.536、10.977、18.720,P=0.001、0.017、0.023、0.004、0.000）。 血清結(jié)核抗體檢測(cè)操作簡(jiǎn)單快速，但存在假陽(yáng)性和假陰性的問題。本研究中觀察組和對(duì)照組血清結(jié)核抗體的檢測(cè)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，診斷符合率為67.7%，Kappa值為0.362＜0.4，說明血清結(jié)核抗體與非典型肺結(jié)核診斷一致性較差，在相關(guān)研究[10-12]中的結(jié)核抗體陽(yáng)性率為30.8%~73.3%。存在較大的變異，所以，2011年WHO建議不再使用結(jié)核抗體檢測(cè)結(jié)核感染。PPD試驗(yàn)至今仍廣泛使用。但該方法在卡介苗疫苗接種或非結(jié)核接觸者易出現(xiàn)假陽(yáng)性,同時(shí)在一些特殊人群如HIV感染、全身性感染等人群中易造成假陰性[13],本研究中PPD試驗(yàn)的在非典型肺結(jié)核的診斷效能高于血清結(jié)核抗體,但價(jià)值有限（Kappa值＜0.4）。而TB-IGRA是一種新的用于結(jié)核桿菌感染的體外免疫診斷方法，TB-IGRA通過選取存在于結(jié)核桿菌,但在卡介苗和大多數(shù)非結(jié)核桿菌中普遍缺失的RD1區(qū)編碼的ESAT-6和CFP-10作為結(jié)核桿菌特異性抗原,與新鮮采取的肝素鈉抗凝全血或者PBMC(外周血單個(gè)核細(xì)胞)充分混合孵育后,應(yīng)用酶聯(lián)免疫法或者免疫斑點(diǎn)法檢測(cè)特異性γ-干擾素的釋放。結(jié)果不受卡介苗干擾，提高了結(jié)果的特異性。從本結(jié)果看TB-IGRA在診斷非典型肺結(jié)核的敏感度、特異度明顯高于血清結(jié)核抗體檢測(cè)和結(jié)核菌素試驗(yàn),分別為95.2%、95.7%,與黃其俊等[14-15]結(jié)果一致,在結(jié)核病診斷中具有重要價(jià)值和明顯優(yōu)勢(shì)。

在全球所有傳染性疾病中,結(jié)核病已成為成年人的首要死亡原因[16]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)是全球22個(gè)結(jié)核病流行嚴(yán)重的國(guó)家之一,被WHO列為結(jié)核病高負(fù)擔(dān)、高危險(xiǎn)性國(guó)家之一[17]。通過酶免法檢測(cè)外周血中結(jié)核感染后特異性細(xì)胞因子γ-干擾素來診斷是否存在結(jié)核感染已被列入英美等發(fā)達(dá)國(guó)家的臨床診治指南[18]，同時(shí)，已獲國(guó)家衛(wèi)計(jì)委批準(zhǔn)并在2018年5月1日實(shí)施的肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)WS288-2017中增加了將γ-干擾素釋放試驗(yàn)用于結(jié)核病的輔助診斷。但由于TBIGRA價(jià)格昂貴，在一定程度上限制了此項(xiàng)目的推廣應(yīng)用，另外一方面，TB-IGRA作為結(jié)核感染的輔助診斷方法，不能有效區(qū)分LTBI和活動(dòng)性TB，也不能準(zhǔn)確預(yù)測(cè)LTBI發(fā)展為活動(dòng)性結(jié)核的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)也不推薦以IGRAs代替PPD試驗(yàn)用于健康人群公共衛(wèi)生干預(yù)中的篩查手段[19]，所以，對(duì)結(jié)核的診斷、治療和預(yù)防工作任重道遠(yuǎn)，相信未來可發(fā)現(xiàn)更為特異的結(jié)核抗原作為刺激原,不斷提高結(jié)核的早期診斷和治療水平,有效控制并降低結(jié)核病的發(fā)生率和死亡率。

綜上所述,結(jié)核感染T細(xì)胞檢測(cè)在非典型性肺結(jié)核的診斷中具有重要價(jià)值，同時(shí)，全面細(xì)致的觀察是正確診斷的基礎(chǔ),并及時(shí)提出進(jìn)一步檢查的意見，減少誤診率的發(fā)生。