EV71對HFMD 患兒樹突狀細胞、MAPK 信號通路及炎性細胞因子的影響

宋麗，楊金玲

(1.鄭州大學第三附屬醫院兒內科，河南 鄭州 450052；2.濟源市婦幼保健院兒科，河南 濟源 454650)

手足口病 （hand foot mouth disease，HFMD）是臨床上較為常見的兒童流行疾病,相關臨床隨訪研究顯示,臨床上HFMD的發病率可達234~56 6/1萬人左右,在部分大流行或者爆發的地區,HFM D的發病率更高[1,2]。

腸道病毒EV71型是導致HFMD感染的重要病原體，對于腸道病毒EV71型引起的相關HFMD患兒致病機制的研究,能夠為臨床上HFMD的生物學治療提供理論基礎。腸道病毒EV71型能夠通過對樹突狀細胞（DCS）的激活,誘導體內T淋巴細胞或者體液免疫功能的恢復,并通過激活p-p38 MAP K、p-JNK和p-ERK1/2相關信號通路蛋白的上升，促進MAPK下游相關因子的激活,加劇不同的炎癥細胞對于皮膚黏膜的損害[3-5]。已有的相關研究揭示了腸道病毒EV71型的感染與HFMD患兒不良臨床結局的關系，但缺乏對于腸道病毒EV71型在HFMD發病機制過程中的相關生物學機制的研究。為了進一步揭示腸道病毒EV71型在促進HFMD患兒病情進展過程中的作用,本次研究選取2016年2月至2017年3月在我院住院治療的HFMD患兒64例，探討了腸道病毒EV71對DCS細胞的激活及對于體內細胞炎癥因子的上調作用,報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年2月至2017年3月在我院住院治療的HFMD患兒64例，其中男35例，女29例；年齡8個月～5歲，平均年齡（2.01±0.97）歲；輕癥 38例（輕癥組），重癥 26例（重癥組）；納入標準：⑴診斷符合衛生部《手足口病診療指南（2010 年版）》和《腸道病毒 71 型（EV71）感染重癥病例臨床救治專家共識（2011年版）》中標準；⑵實驗室明確為腸道病毒EV71型感染；⑶年齡≤5歲；⑷患兒監護人知情同意。排除標準：⑴有腎病綜合征、免疫系統性疾病等慢性基礎性疾病；⑵先天性心臟病或肺發育不良者；⑶長期服用糖皮質激素者。同時選取健康兒童60例作為對照組，各組受試者性別、年齡比較差異無統計學意義 （P＜0.05），見表 1。

1.2 實驗方法

表1 各組一般資料比較

1.2.1 DCs分離、培養 收集30ml外周血，裂解外周血血漿中紅細胞，離心獲得單個核細胞，于青霉素、37℃、5%二氧化碳條件下培養,加入100mg/dl的集落刺激因子，50mg/dl的IL-4促進DCs的分化。培養第6d后，收集細胞，調整濃度為1×109cells/L。

1.2.2 表面標志物細胞數檢測 采用流式細胞儀雙標法分別對CD80和CD83以及CD86和CD11c進行檢測，熒光標記分別為CD80-PE/CD83-FITC，CD86-PE/CD11c-FITC,操作于5ml試管中進行,100μl DCs細胞與 CD80和 CD83(CD86和 CD11c)熒光標記抗體室溫反應25min,采用紅細胞裂解液optiLYse C溶血素溶解紅細胞，PBS液體洗滌三遍,每次5min,生理鹽水重新懸浮細胞,上機檢測。(FACS calibur流式細胞儀購自美國BD公司）。

1.2.3 MAPK信號通路蛋白檢測 冰上分離細胞蛋白,冰上靜置60min,室溫下20000r/min離心60 min，取出下層沉淀。按總蛋白80斗g計算上樣容積,按照比例為3：1或者4：1的比例上TBS緩沖液，加入20μl緩沖液后于45 V電壓下進行電泳操作,脫脂蛋白封閉2h，加入p-p38 MAPK、p-JNK和p-ERK1/2抗體（鼠來源抗體，購自上海碧云天生物技術有限公司）各10μl后室溫下孵育2h，2h后加入二抗，室溫孵育1h（兔來源抗體，購自南京凱基生物科技有限公司）。采用日本panasoic公司的HSO-900系統影像分析儀器進行圖像分析。

1.2.4 炎性細胞因子檢測 收集DCs細胞上清液，1000r/min離心5min，采用生物酶聯免疫吸附法檢測相關指標，IL-6和TNF-a、IL-12檢測試劑盒購自羅氏生物檢測應用公司,配套試劑及儀器購自南京伯斯金生物科技有限公司。

1.3 統計學處理 統計分析采用SPSS19.0軟件，計量資料采用（)表示，多組間比較使用方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組DCs表面標志物檢測結果比較 重癥組CD80和 CD83明顯高于輕癥組和對照組 （P＜0.05）；輕癥組CD80和CD83明顯高于對照組（P＜0.05）；三組CD86和CD11c比較差異無統計學意義（P＞0.05）。說明EV71感染可誘導DC趨向成熟。見表2、表3和圖1。重癥組中死亡和非死亡患兒CD80、CD83、CD86和CD11c比較差異無統計學意義（P＞0.05），見表 4。

表2 各組DCs表面標志物檢測結果比較

表3 各組DCs表面標志物檢測結果比較(平均熒光強度)

表4 重癥死亡和非死亡患兒DCs表面標志物檢測結果比較

表5 重癥死亡和非死亡患兒DCs表面標志物檢測結果比較(平均熒光強度)

2.2 各組MAPK信號通路相關蛋白比較 重癥組p-p38 MAPK、p-JNK和p-ERK1/2表達顯著高于輕癥組和對照組（P＜0.05）；輕癥組 p-p38 MAPK、p-JNK和p-ERK1/2表達顯著高于對照組 （P＜0.05）；說明EV71感染可激活MAPK信號通路。見表6和圖2。重癥組中死亡和非死亡患兒p-p38 MAPK、p-JNK和p-ERK1/2表達比較差異無統計學意義（P＞0.05），見表 7。

圖1 各組DCs表面標志物檢測結果圖

表6 各組MAPK信號通路相關蛋白比較

表7 重癥死亡和非死亡患兒MAPK信號通路相關蛋白比較

圖 2 Western blot法檢測圖（1：對照組；2：輕癥組；3：重癥組）

2.3 各組炎性細胞因子比較 重癥組IL-6顯著高于輕癥組和對照組（P＜0.05）；重癥組TNF-顯著高于對照組，但低于輕癥組（P＜0.05）；輕癥組IL-6和TNF-顯著高于對照組（P＜0.05）；三組 IL-12 比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表8。重癥組中死亡患 IL-6 為（80.42±9.28）pg/ml，明顯高于非死亡患兒（P＜0.05），而 TNF-為（24.02±6.10）pg/ml，明顯低于非死亡患兒（P＜0.05），見表 9。

表8 各組炎性細胞因子比較

表9 重癥死亡組與非死亡組炎性細胞因子比較

3 討論

手足口病的病因相對復雜,雖然腸道病毒EV 71以及科薩奇病毒科相關亞組病毒的感染可以導致明顯的腸道局部黏膜腺體以及全身循環系統表現，特別是明顯的神經系統受累表現，但其具體作用機制無法確定。輕癥手足口病患兒的預后較好，多數可在一周內自愈，而重癥患兒的發病較急、化膿性腦膜炎以及腦實質受累的表現可在3~6h內引起明顯的腦膜刺激癥狀，進而引起呼吸循環功能衰竭[6,7]。現階段臨床上不同的方式治療HFMD的臨床總體有效率較低，治療后的病情緩解率不足35%[8]，而通過對于HFMD發病過程中相關分子機制或者生物學機制的研究,具有下列幾個方面的現實意義：⑴能夠為臨床上HFMD患兒的早期疾病診斷或者臨床預后評估提供參考；⑵能夠為臨床上HFMD患兒的治療提供理論基礎,特別是通過對于信號通路受體拮抗劑的相關研究,能夠為HFMD的治療提供潛在的參考。

DCS細胞是體內重要的抗原提呈細胞,其能夠通過促進相關下游CD4T淋巴細胞或者CD8T淋巴細胞等的激活，提高患兒局部細胞免疫功能，改善患者的臨床預后[9,10]。DCS的表達或者細胞濃度的維持，能夠為感染性疾病的免疫屏障的維持、提高病原體的吞噬效果等提供幫助[11,12]。MAPK信號通路不僅能夠在影響到惡性腫瘤的發生過程中起到一定的作用,同時還可以在促進氧化應激反應、提高炎癥反應的損傷程度,加劇自然殺傷性T淋巴細胞的自身細胞毒性作用等,促進皮膚黏膜組織或者重要內臟器官組織的損傷[13]。

CD80和CD83是評估DCS細胞成熟程度的重要細胞表面抗原,其表達濃度的上升往往提示DCS細胞的成熟，T淋巴細胞免疫活性的提升[14,15]。本次研究中可以發現的是病例組患者血清中相關抗原指標均明顯高于對照組,其中重癥組患者的相關指標表達高于輕癥組,而輕癥組患者高于正常對照組，差異具有統計學意義,這些均提示了腸道病毒EV71對于DCS的分化成熟作用,這從機制上考慮可能與下列幾個方面的因素有關：⑴腸道病毒E V71能夠促進單核細胞或者巨噬細胞表面抗原表位的釋放,通過正反饋機制促進CD80或者CD8 3的表面抗原的濃度的維持。CD86和CD11c等是評估DCS細胞另一重要表面抗原,但本次研究中并未發現相關指標的上升,提示腸道病毒EV71并不能對于全部的DCS表面抗原均具有一定的協同刺激作用。馮愛東等[16]在探討了36例樣本量的重癥HFMD患者的血清學資料后發現,腸道病毒EV71能夠提高25%～65%左右的CD80的表達陽性率，且腸道病毒EV71的感染時間越長、病原體擴增速度越快，CD80的陽性率越高。重癥組p-p38 MAPK、p-JNK和p-ERK1/2相關蛋白水平的表達均有所上升,高于輕度組或者對照組,提示MA PK信號通路的激活在促進HFMD的病情進展過程中具有顯著的作用，而腸道病毒EV71可能在影響到MAPK信號通路的上調方面發揮了一定的作用，這主要考慮與腸道病毒EV71對于MAPK信號過程中JNK蛋白的轉錄或者上游相關啟動子的調控增強有關。但是在重癥組中死亡和非死亡患者中，并非發現MAPK信號通路蛋白或者CD80等表面抗原的表達差異,提示相關分子生物學因子并不能作為臨床上評估不同臨床預后的差異性指標。最后,本次研究發現重癥組IL-6的高表達及TNF-a的表達波動等，均能夠影響到下游炎癥細胞的浸潤，促進皮膚黏膜的損傷，加大病死率的發生。

綜上所述，EV71可促進CDs細胞成熟,激活MAPK信號通路,促進部分炎性因子釋放；患兒預后與CDs及MAPK信號通路未見明顯聯系。