溶血對腦脊液蛋白檢測的干擾研究

余曉慧 ，劉靜 ，鄔艷 ，陳晶

（1.瑞昌市人民醫院，江西 九江 332200；2.南昌大學第二附屬醫院，江西 南昌 330006；3.南昌市東湖區疾病預防控制中心，江西 南昌 330006；4.南昌大學醫學院，江西 南昌 330006）

腦脊液（CSF）是存在于腦室和蛛網膜下腔的一種無色透明液體，對腦和脊髓具有保護、支持和營養等多種功能[1]。正常CSF中存在著蛋白質、葡萄糖、氯化物和酶類等化學物質，各類成分含量保持相對穩定,以保證CSF發揮正常的生理功能[2]。經典的CSF蛋白質包括總蛋白 （TP）和微量蛋白（mALB），TP常用于輔助診斷中樞神經系統炎癥、神經根病變及椎管內梗阻性腦病,也常用于鑒別細菌性與非細菌性感染[3]，而mALB主要經血腦屏障滲透而來，被認為是評價血腦屏障完整性的理想參數[4]，因此CSF中TP和mALB的準確檢測有重要臨床價值[5]。但在檢驗工作中，我們發現有部分CSF標本由于蛛網膜下腔出血或穿刺導致黃變（輕微溶血）或溶血現象，由于CSF標本不易獲取，檢驗科往往會做讓步檢驗,但溶血對CSF標本中的蛋白成分檢測的影響如何,尚未見相關報道。本研究中,我們依據中華人民共和國衛生行業標準WS/T 416-2013《干擾實驗指南》對溶血干擾CSF蛋白的檢測進行干擾研究，探討不同溶血程度對CSF蛋白檢測結果的影響，為檢驗人員更好地了解檢驗結果，為臨床提供更準確的解釋提供實驗依據，也為其他CSF檢測項目的干擾研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 研究對象 選擇TP和mALB濃度分別接近正常生物參考區間上限的CSF標本各1例,外觀清亮，經Sysmex全自動血細胞分析儀檢測CSF標本中血紅蛋白（Hb）含量為0g/L，此為基礎樣品。同時收集同一病人的血常規標本備用。

1.1.2 主要儀器和試劑 Beckman AU5400全自動生化分析儀，CSF-TP檢測試劑盒為中山標佳生物科技有限公司的尿液總蛋白檢測試劑盒,方法為鄰苯三酚紅鉬（PRM）比色法；CSF-mALB檢測試劑盒為DiaSys公司微量白蛋白測定試劑盒,方法為免疫透射比濁法,兩者均使用配套校準品和質控品。Sysmex XE-2100全自動血細胞分析儀，使用原裝配套試劑和質控品。

1.2 實驗方法

1.2.1 干擾物（溶血）原液的制備 取上述血常規標本2ml，3000g離心3min，小心吸出上層血漿棄去，剩下約1ml紅細胞轉移到干凈試管中,加入5ml生理鹽水輕輕顛倒混勻,充分洗滌紅細胞,3000g離心3min,小心吸出上層液體棄去，繼續將紅細胞以同樣的方法清洗5次,對最后一次上清液進行TP和mALB濃度檢測,直到其濃度<0.1mg/L為止,如不合格則繼續進行清洗直到合格為止。清洗結束后，加入200μl蒸餾水混勻制得紅細胞懸液，以注射器反復吹打徹底溶解紅細胞，3000g離心3min吸取上層溶血液體即為干擾物原液，以Sysmex XE-2100全自動血細胞分析儀檢測Hb濃度并記錄。此處需注意溶解紅細胞要徹底才能獲得高Hb濃度的干擾物原液。

1.2.2 干擾物劑量效應評價實驗

1.2.2.1 干擾物高實驗濃度樣品與低實驗濃度樣品制備 見表1。

表1 實驗樣品制備方法

1.2.2.2 實驗樣品系列的制備 將上述制得的干擾物高實驗濃度樣品與低實驗濃度樣品定量混合，可得到干擾物濃度介于兩樣品之間的一系列實驗樣品。確定線性劑量相關關系時需要5個濃度水平。見表2。

表2 干擾物不同濃度系列樣品的制備

1.2.2.3 TP和mALB測定 用Beckman AU5400全自動生化分析儀檢測上述樣品中TP和mALB濃度，儀器質控在控狀態下進行實驗。所有樣品一次檢測完成，所有操作均嚴格按照實驗室操作規程進行。每個樣品重復檢測3次，將上述系列樣品按升序（1、2、3、4、5）進行第一次檢測，再按降序（5、4、3、2、1）進行第二次檢測，再按升序進行第三次檢測。記錄結果。

1.3 數據處理與分析 計算最低干擾物濃度樣品的測定均值，分別用5個水平樣品的測定均值減去此均值得出不同濃度干擾物的干擾效果。以干擾效果為Y值，干擾物濃度為X值，繪出干擾物劑量相關曲線。根據曲線趨勢進行數據分析。如果為線性相關，則計算線性回歸方程；如果為非線性相關，則采用非線性回歸分析得出相應的最佳擬合曲線與數學模型。根據回歸方程或數學模型可推斷出在評價范圍內任意干擾物濃度所引起的干擾效應值。

2 結果

2.1 干擾物（溶血）原液中Hb濃度 本次實驗選取了2名患者的CSF標本，分別用于研究溶血對CSF中TP和mALB的干擾效應。以Hb濃度來表示標本的溶血程度，標本中Hb濃度越高則表示標本溶血越明顯。用此2位病人的血常規標本分別制作了干擾物（溶血）原液，TP的干擾物原液中Hb濃度為201g/L，mALB的干擾物原液中Hb濃度為175g/L。

2.2 干擾效果 用Beckman AU5400全自動生化分析儀檢測實驗樣品系列,結果見表3和表4。

表3 CSF-TP干擾物濃度及干擾效果

表4 CSF-mALB干擾物濃度及干擾效果

2.3 干擾效果的回歸分析 以干擾效果為Y值，干擾物濃度為X值，繪出干擾物劑量相關曲線。溶血程度與CSF中TP檢測的干擾效果為線性相關、正向干擾，溶血程度越高,干擾越明顯,對mALB的干擾效果不明顯,溶血程度與干擾效果之間無相關性,見圖 1、圖 2。

圖1 溶血對CSF中TP檢測的干擾效果

圖2 溶血對CSF中mALB檢測的干擾效果

3 討論

近年來隨著檢驗技術的快速發展,大部分檢驗項目實現了自動化，檢驗過程實現了精準控制，這大大提高了檢驗結果的準確性。也正是因為如此，檢驗前因素如標本溶血、脂濁和黃疸等對檢驗結果的干擾也越來越凸顯,因此,充分研究并了解檢驗前因素對檢驗的干擾作用有助于檢驗人員對結果做出正確的判斷,并為臨床提供可靠的診斷依據[6]。

標本溶血是檢驗前干擾因素中最常見的一種[7,8]，其影響檢測結果的機制主要有三方面：⑴紅細胞內的高濃度物質如K、LDH、AST等隨溶血進入待檢標本后，使相應物質的濃度增加；⑵血紅蛋白本身吸光度的干擾;⑶某些紅細胞成分對化學反應的干擾[9]。PRM比色法檢測CSF-TP的原理為鄰苯三酚紅與鉬酸鹽結合形成紅色復合物,在酸性條件下，該復合物與總蛋白結合，從而使蛋白的最大吸收波長由467nm轉換為598nm,并產生藍紫色,儀器根據吸光度的變化計算CSF-TP的含量[10]。Hb在體內除原始形態外,還存在氧合血紅蛋白和高鐵血紅蛋白等形式,吸收光譜覆蓋540nm～630nm[11-13]，造成PRM比色法在598nm處的吸光度增加，進而錯誤地表現為待測物濃度增加,而在本研究中則表現為溶血對CSF-TP檢測的正干擾,且干擾幅度極大，每克Hb的干擾效果遠超衛健委推薦的允許總誤差10%，因此溶血標本不適合進行CSF-TP的檢測。應用免疫透射比濁法檢測CSF-mALB的原理是羊抗人白蛋白抗體和樣品中的白蛋白進行抗原抗體反應，待反應完成后，用透射比濁檢測吸光度的變化反映白蛋白的濃度。本文結果顯示，低濃度的Hb對免疫透射比濁法檢測CSF-mALB基本無干擾,這與試劑說明書所宣稱的一致（Hb≤2.5g/L時無干擾），也與此前的文獻報道相一致[14]，當Hb濃度＞4g/L時,本結果顯示其干擾效果也不明顯，但仍有待其他研究的進一步驗證。該反應使用的檢測波長為415nm，而且抗原抗體的反應相對特異性高，可能是mALB檢測受Hb影響小的主要原因,因此臨床上對于有溶血的CSF標本可以進行mALB的檢測。

臨床上針對溶血標本的處理有多種方法，如增加副波長檢測、Hb單克隆抗體、統計學消除等，但這都是標本采集后處理，不僅操作繁瑣，而且有些干擾是不可消除的[15]。對此，檢驗工作人員應了解溶血對檢測項目的干擾作用,為臨床提供正確的解讀，同時也應積極與醫護溝通，著重培訓正確的采樣程序，從源頭減少溶血標本的產生，這樣才能切實提高實驗室水平，保證檢驗質量。