YKL-40在卵巢癌細胞生長中的作用

梅琳琳，王雅莉，李紅娟，張慧

（鄭州大學附屬鄭州中心醫院婦產科，河南 鄭州 450007）

近年來臨床上卵巢癌的發生風險明顯上升，同時卵巢癌患者的生存預后指標并無明顯的改善。流行病學研究證實，卵巢癌的平均發病率維持在252~727/10萬人左右,在具有卵巢惡性上皮性腫瘤家族史的女性群體中,卵巢病變的風險可進一步上升[1]。腫瘤相關蛋白的表達，能夠影響上皮細胞的早期增殖調控、癌細胞的粘附能力或者浸潤能力,進而參與到生殖系統惡性腫瘤的發生過程。人類軟骨糖蛋白 （YKL-40）是重要的分泌型糖蛋白，其能夠通過結合細胞膜上的糖蛋白配體，激活細胞膜內的多種信號通路,導致上皮細胞的增殖速度的改變[2,3]。基礎方面的研究證實，YKL蛋白能夠誘導癌細胞的分化成熟障礙,導致癌細胞對于基底膜組織的突破風險明顯的增加[4]。少量的研究探討了YKL-40蛋白在子宮內膜癌或者甲狀腺癌等中的表達情況，發現YKL-40表達濃度的上升是促進惡性腫瘤發生及臨床預后惡化的重要風險[5]，但在卵巢癌中的分析研究不足。為了揭示卵巢癌的發病機制，分析YKL-40蛋白在促進卵巢癌發生過程中的作用，本次研究分析了YKL-40蛋白在卵巢癌細胞SKOV3中的表達情況及其對于SKOV3細胞的侵襲、化療敏感性等的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞株 卵巢癌細胞SKOV-3，已確認表達YKL-40的人惡性膠質瘤細胞U87作為陽性對照，均購自上海生命科學研究院。

1.2 細胞培養

1.3 構建YKL-40過表達細胞 采用無內毒素質粒提取試劑盒提取和純化EPMI重組質粒及YKL-40質粒，測定濃度，將人惡性膠質瘤細胞U87或者卵巢癌上皮細胞SKOV3鋪于六孔板上，隔日更換培養瓶PRIM60，在細胞融合度為75%~80%時加入脂質體和構建的質粒，并進行篩選，定期更換培養基清除死亡的細胞。

1.4 細胞遷移試驗 采用細胞刮將上室內細胞輕輕刮去,采用磷酸鹽緩沖液洗兩次,每次3min，行多聚甲醛固定液固定,結晶紫染色后顯微鏡下觀察，隨機選3個視野,計數穿膜細胞，根據每個區域的細胞數量計算細胞侵襲能力。

1.5 Western blot檢測 采用細胞裂解液裂解收集的細胞集落,裂解蛋白與上樣緩沖液以5：1的濃度相互混合，80~100℃煮沸5min。根據不同的蛋白分子量水平,配制并灌注相應的12%的分離膠和5%的濃縮膠,按15g／孔蛋白量進行組織蛋白的上樣，進行SDS．PAGE電泳,電泳后根據條帶進行切膠,半濕法轉移至硝酸纖維素膜，BSA蛋白封閉2h，加入含 10%BSA一抗及二抗（1：1000），磷酸鹽緩沖液清洗3次，每次5min，進行曝光及膠片弧度的讀取。

1.6 CCK-8試驗 在96孔板中接種細胞懸液（100μl/孔），向每孔加入 10μl CCK8 溶液，將培養板在培養箱內孵育1~4h，用酶標儀測定在450nm處的吸光度，若暫時不測定OD值，可以向每孔中加入10μl 0.1M的HCL溶液或者1%w/v SDS溶液，24h內測定，吸光度不會發生變化。

1.7 統計學處理 統計分析采用SPSS19.0軟件，計量資料采用（)表示，兩組間比較使用t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SKOV-3和U87細胞YKL-40蛋白表達比較SKOV-3細胞YKL-40蛋白表達量明顯低于U87細胞（P＜0.05）,可見 SKOV-3細胞基本不表達 YK L-40蛋白。見表1和圖1。

2.2 YKL-40過表達對SKOV-3細胞遷移影響YKL-40過表達組SKOV-3細胞遷移數明顯高于對照組，比較差異有統計學意義（P＜0.05），見表2和圖2。

表1 SKOV-3和U87細胞YKL-40蛋白表達比較（，n=6)

表1 SKOV-3和U87細胞YKL-40蛋白表達比較（，n=6)

細胞 YKL-40蛋白表達SKOV-3 U87 t P 0.004±0.001 0.986±0.032-75.132 ＜0.05

圖1 Wetern blot檢測圖

表2 對照組和YKL-40過表達組細胞遷移數比較（，n=6)

表2 對照組和YKL-40過表達組細胞遷移數比較（，n=6)

分組 SKOV-3細胞遷移數（個）對照組YKL-40過表達組t P 104.39±20.03 270.31±25.60-12.503 ＜0.05

圖2 細胞遷移圖

2.3 YKL-40過表達抑制順鉑對SKOV-3細胞殺傷作用 在 1μg/L、2.5μg/L、5μg/L 順鉑下，YKL-40過表達組SKOV-3細胞抑制率明顯低于對照組（P＜0.05），見表 3。

表3 不同順鉑作用下兩組細胞抑制率比較（，n=6)

表3 不同順鉑作用下兩組細胞抑制率比較（，n=6)

分組 1μg/L順鉑下細胞抑制率（%）對照組YKL-40過表達組2.5μg/L順鉑下細胞抑制率5μg/L順鉑下細胞抑制率t p 17.82±3.32 3.21±1.01 10.313＜0.05 30.03±3.50 17.20±2.78 7.031＜0.05 67.98±4.10 45.59±3.89 9.704＜0.05

3 討論

基因突變、遺傳及環境的交互作用等，均能夠增加卵巢惡性腫瘤的發生風險。而現階段臨床上卵巢癌的總體治療效果較為局限,包括卵巢癌根治性手術、卵巢癌腫瘤減滅術及術后放化療等措施,雖然能夠減輕卵巢腫瘤患者的高腫瘤負荷表現,改善患者短期內的臨床癥狀,但其治療后的病情緩解率水平或者遠期的生存預后改善程度并不理想[6]。一項囊括了多中心的隨機分析研究揭示了卵巢癌的治療預后轉歸,發現卵巢癌的三年生存率不超過38%，同時無進展生存期不超過28個月[7]。而本次研究對于卵巢癌上皮性細胞株SKOV3的分析，具有下列幾個方面的作用：⑴能夠為卵巢癌上皮細胞的發病病因進行進一步的揭示和闡述，從而為卵巢癌的免疫靶向治療提供作用靶點；⑵能夠為卵巢癌靜脈化療耐藥的機制進行分析，為提高卵巢癌的化療敏感性提供依據。

YKL-40是重要的膜分泌型蛋白，其結構上具有多重重復的絲氨酸磷酸化結構，能夠穩定結合細胞膜上的糖蛋白結構，激活細胞膜內側的三磷酸成分，促進細胞內第二信使的上調，干預細胞內的信號傳導機制。YKL-40蛋白能夠在激活細胞內多種的腫瘤相關信號通路上發揮作用，提高MAPK及AKT信號通路的激活程度，提高細胞核內的轉錄基因的活性[8]；基礎領域的研究還證實，YKL-40蛋白能夠影響癌細胞的生物學特性，導致癌細胞對于淋巴結及血管內皮細胞的粘附能力的升高[9]；YKL-40還能夠導致癌細胞異型性的改變，影響腫瘤組織的分級程度[10,11]。部分研究揭示了YKL-40在乳腺癌等惡性腫瘤中的表達情況，認為YKL-40的表達的上升是促進乳腺癌臨床分期進展的風險因素[12]，但對于YKL-40與卵巢癌細胞SKOV3的關系研究較少。

在SKOV-3細胞中蛋白水平的分析可以發現，YKL-40蛋白的表達濃度較低，基本呈現出不表達的狀態，YKL-40的表達濃度的下降提示了在上皮性腫瘤細胞中，SKOV3可能并不參與到卵巢癌的早期發生過程，其后期的YKL-40蛋白的表達異常可能與卵巢癌細胞在后續的增殖、分化障礙過程中的獲得性表達有關。但鑒于本次研究采用的是人腦惡性膠質瘤細胞作為對照組，YKL-40蛋白的表達下降可能僅僅提示其表達濃度的相對性下降。在轉染了YKL-40蛋白后，卵巢癌上皮細胞SKOV3的侵襲能力明顯增強，提示了YKL-40蛋白對于卵巢癌細胞生物學特征的改變作用，薈萃國內外的相關基礎領域的研究，筆者認為YKL-40對于卵巢癌細胞的侵襲能力的改變主要與下列因素有關[13]：⑴YKL-40能夠提高卵巢癌細胞形成偽足的能力，導致癌細胞的變形能力及浸潤能力的增加；⑵YKL-40能夠促進卵巢癌上皮細胞間質成分的分解，降低癌細胞的細胞間粘附能力。劉炎等[14]研究者也發現，在卵巢癌浸潤深度較深或者轉移風險較高的人群中，卵巢癌腫瘤病灶組織中的 YKL-40表達濃度可平均上升27%以上，同時卵巢癌患者的臨床分期越晚、治療后的腫瘤復發率越高，YKL-40的表達濃度越高。卵巢癌的靜脈化療對于卵巢的治療預后意義重大，化療敏感性的下降能夠顯著增加腫瘤復發率和卵巢癌患者的病死率，導致患者臨床轉歸的惡化，本次研究中順鉑作用后的卵巢癌細胞均存在明顯的凋亡表現，但過度表達 YKL-40的卵巢癌上皮細胞SKOV3其細胞凋亡比例明顯的下降，低于空白處理組SKOV3細胞，差異較為明顯，提示了YKL-40蛋白對于卵巢癌細胞的凋亡具有一定的抑制作用，其能夠降低SKOV3細胞的化療敏感性，這可能主要與 YKL-40對于卵巢癌細胞對于順鉑藥物的吸收速率的減慢、囊泡排泄化療藥物作用的增強等機制有關[15]。

綜上所述，卵巢癌SKOV-3細胞不表達YKL-40蛋白,而YKL-40可增強SKOV-3細胞遷移能力，降低SKOV-3細胞鉑類藥物的敏感性，值得進一步研究。