東莞地區(qū)人群ApoE 基因多態(tài)性及其與冠心病、高血壓的相關(guān)性分析

雷亞利，杜華，華仙麗，梁愛芬，隋洪

（東莞康華醫(yī)院檢驗科，廣東 東莞 523000）

載脂蛋白（ApoE）是人體脂質(zhì)代謝的糖蛋白。載脂蛋白E由第112和158氨基酸位點核苷酸多態(tài)性形成不同的基因型別。載脂蛋白（ApoE）基因型別包括基因112TT+158CC型 （載脂蛋白 ε3/ε3型 ）、112TT+158TT 型 （載 脂 蛋 白 ε2/ε2 型 ）、112CC+158CC 型 （載脂蛋白 ε4/ε4 型）、112T/C+158CC 型 （載脂蛋白 ε3/ε4 型）、112TT+158T/C 型（載脂蛋白 ε2/ε3 型）、112T/C+158T/C （載脂蛋白ε2/ε4型）。不同的載脂蛋白基因型別在脂質(zhì)代謝中有差異。研究顯示載脂蛋白ε4等位基因是高血壓和冠心病等腦血管疾病重要危險因素[1-3]。而不同型別的載脂蛋白E基因型別扮演著不同等級的危險因素，其中ε4等位基因遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于ε3等位基因[3-4]。雖然載脂蛋白E基因是阿爾茨海默病（AD）重要的危險因素中得到較為廣泛的認(rèn)可[5-7]，但在其它高血壓和心血管疾病的研究較少。因此，加強(qiáng)載脂蛋白E基因在其它脂質(zhì)代謝類疾病的相關(guān)性研究是很有必要的。特別是隨著載脂蛋白E基因檢測方法多樣化和簡易化,載脂蛋白E檢測結(jié)果數(shù)據(jù)會進(jìn)一步累積。通過對累積的大數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,將在非傳染性慢病病人管理中提供更多有益的經(jīng)驗。本文通過對東莞地區(qū)人群ApoE基因多態(tài)性的分析,探討了其與高血壓、冠心病的關(guān)系；驗證了ApoE基因多態(tài)性與罹患冠心病和高血壓的風(fēng)險，現(xiàn)報告如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選取2017年1月至2018年9月期間3249例來東莞康華醫(yī)院門診、住院就診者為研究對象，按照下列標(biāo)準(zhǔn)將人群分為五組。上述患者均簽署知情同意書。

1.2 研究對象分組 選取2017年1月至2018年9月期間3249例來東莞康華醫(yī)院門診、住院患者為整體人群。其中整體人群的年齡范圍16~97歲；男性人群2189例，女性人群1060例。體檢中心人群不存在高血壓或是冠心病的人群為正常對照組。上述組別在年齡性別分布上面差別無統(tǒng)計學(xué)意義。患者均簽署知情同意書。其中高血壓患者636例、冠心病患者457例及高血壓合并冠心病患者258例，依據(jù)嚴(yán)格的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)確認(rèn)。

1.3 試劑和儀器 使用珠海賽樂奇生物技術(shù)股份有限公司（注冊證號：國食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2013第3401270號）基因芯片方法對患者血樣進(jìn)行分析。其中載脂蛋白基因分型包括基因的提取 （使用廣州美基生物科技有限公司生產(chǎn)的血液基因組DNA提取試劑盒，備案號：粵穗械備20150062），基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增（ABI 2720），使用基因芯片閱讀儀進(jìn)行產(chǎn)物分析。

1.4 檢測方法 所有研究對象抽取靜脈血1~2ml送檢，載脂蛋白基因分型檢測包括如下步驟：⑴基因的提取；⑵基因組DNA的PCR擴(kuò)增；⑶使用基因芯片閱讀儀進(jìn)行產(chǎn)物分析。基因芯片試劑盒所采用的PCR體系是經(jīng)一系列的優(yōu)化處理后建立的直用型PCR體系,可以實現(xiàn)對ApoE基因特異性目的片段的有效擴(kuò)增。進(jìn)行檢測時,先把待測樣本用樣本處理試劑盒處理后提取DNA,先通過PCR擴(kuò)增并變性后得到標(biāo)記的目的寡核苷酸鏈,在特定條件下與含有捕獲探針的功能化基因芯片進(jìn)行雜交。當(dāng)反應(yīng)體系中含有ApoE基因目的核酸時，捕獲探針就會通過互補(bǔ)序列與目的核酸結(jié)合，隨后HRP-TMB擴(kuò)增顯色系統(tǒng)就會啟動,此時生物傳感器功能化涂層就會產(chǎn)生信號放大，呈現(xiàn)藍(lán)色，即陽性結(jié)果，從而實現(xiàn)結(jié)果判讀。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理分析 單核苷酸多態(tài)性 （SNP）位點的基因型頻率和等位基因頻率通過頻率計算法計算。采用 χ2檢驗分析各 SNP位點是否符合Hardy-Weinberg遺傳平衡,采用統(tǒng)計軟件 SPSS 21.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗,以 P<0.05為結(jié)果差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 載脂蛋白E基因人群總體分型結(jié)果 通過對東莞康華醫(yī)院3249例整體人群的脂載蛋白E基因多態(tài)性分析，其中ε3等位基因2374例占73.06%（ε3/ε3 型占比 71.68%，ε2/ε4 型為 1.38%）；ε2等位基因 456例占 14.04%（ε2/ε2型為 0.65%，ε2/ε3型占比 13.39%）；而 ε4等位基因 419例占比12.90% （ 其 中 ε4/ε4 型 占 比 0.83% ，ε3/ε4 型 為12.07%）。

圖1 載脂蛋白E在人群中的總體分布

2.2 載脂蛋白E基因等位基因人群總體頻率分布3249例就診者中，ApoE基因的388T>C（rs429358）位點共檢出野生型2758例,雜合突變型437例，純合突變型27例,等位基因突變發(fā)生率7.56%。ApoE基因526C>T（rs7412）位點共檢出野生型2748例，雜合突變型480例，純合突變型21例,等位基因突變發(fā)生率9.43%。經(jīng)χ2檢驗分析,上述多態(tài)性位點突變頻率觀察值符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律(P>0.5)，具有群體代表性。見表1。

2.3 各組別ApoE基因型和等位基因頻率分布情況及分布差異 冠心病組ε2等位基因占比（10.94%）低于正常對照組 ε2等位基因占比（15.91%），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；且冠心病組ε2等位基因占比低于高血壓組（14.15%），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；與冠心病合并高血壓組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。冠心病合并高血壓組ε4等位占比（20.16%）高于正常對照組ε4等位占比（13.98%），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見圖 2 。

表1 ApoE基因多態(tài)性頻率分布

圖2 不同人群ApoE基因多態(tài)性分布

正常對照組和高血壓組、冠心病組及高血壓合并冠心病組脂載蛋白E基因型和等位基因頻率分布情況比較，見表2。

3 討論

3.1 ApoE基因多態(tài)性的分布 對以往國內(nèi)外文獻(xiàn)的統(tǒng)計結(jié)果表明，等位基因中ε3等位基因頻率最高，是任一群體中最常見的等位基因，而ε2和ε4則相對較少，所以ε3被認(rèn)為是“野生型”。研究對于載脂蛋白E基因型型別的分布，本文所選的樣本人群達(dá)到3249例。反應(yīng)東莞地區(qū)脂蛋白E基因多態(tài)性的分布其載脂蛋白E的基因型分布與相關(guān)文獻(xiàn)一致[8-11]。

3.2 ApoE基因多態(tài)性與冠心病的關(guān)系 不同載脂蛋白E基因型決定不同的載脂蛋白E配體。在冠心病中不同載脂配體運輸不同的血脂蛋白,特別是在動脈粥樣硬化的脂蛋白[12]。不同的載脂蛋白E基因型別的基因型人群在冠心病中差異明顯。本次統(tǒng)計中冠心病組人群中ε2等位基因比正常對照組人群高；說明ε2等位基因扮演著一個保護(hù)基因的角色。這一結(jié)論與張漢文等[13]通過對歷年文獻(xiàn)進(jìn)行的大數(shù)據(jù)分析中對冠心病與ε4等位基因的關(guān)系的結(jié)論一致；與其對ε2等位基因的分析結(jié)論不一致；這一不一致是由于地域差異引起，還是由于統(tǒng)計偏頗引起尚需進(jìn)一步研究。

此外，根據(jù)最新研究成果，對ε4等位基因攜帶者，棕櫚酸食用量的增加與冠心病風(fēng)險增加有關(guān)[14]，這表明ε4等位基因攜帶者可以通過合理飲食降低相應(yīng)的冠心病的風(fēng)險。

3.3 ApoE基因多態(tài)性與冠心病合并高血壓的關(guān)系冠心病合并高血壓人群中ε4等位基因顯著高于非高血壓非冠心病人群；表明對東莞地區(qū)人群，ε4等位基因在高血壓合并冠心病人群中具有較高比例；說明在樣本量足夠的情況下，同一地區(qū)（生活習(xí)慣相似）的人群中ε4等位基因與罹患冠心病和高血壓的幾率相關(guān)。此外，本研究中表明的冠心病合并高血壓人群ε3/3比率低于單純高血壓與單純冠心病；與較早的文獻(xiàn)中,高血壓合并冠心病者ε3/3頻率比僅高血壓有下降的趨勢相一致[14]；可能揭示ε3/3等位基因?qū)Ω哐獕汉喜⒐谛牟∮斜Ｗo(hù)作用。

隨著對載脂蛋白E檢測方法的多樣性，載脂蛋白E基因檢測將會變成快速準(zhǔn)確的檢測項目。載脂蛋白E將會積累大量的數(shù)據(jù)，這將有利于相關(guān)脂質(zhì)代謝類的相關(guān)疾病的相關(guān)性分析。更多人群數(shù)據(jù)的積累有助于對慢性非感染性疾病發(fā)病機(jī)理和作用機(jī)制的研究。

同時,大數(shù)據(jù)分析也使我們發(fā)現(xiàn)相關(guān)的疾病的基因并不是某一個基因的決定的,而是由多個基因共同決定,也說明一些疾病可能屬于數(shù)量性狀遺傳。更多的數(shù)據(jù)的積累將會使疾病與基因型之間的關(guān)系更加清晰,將會為臨床的診斷提供更多的數(shù)據(jù)支撐。

表2 不同人群載脂蛋白E基因型別分布情況

綜上所述,東莞地區(qū)3249例患者ApoE基因多態(tài)性分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，具有群體代表性。冠心病合并高血壓組與ε4等位基因呈正相關(guān)，冠心病組與ε2等位基因則呈負(fù)相關(guān)。