重組脂聯素對自然流產模型小鼠妊娠結局及Th17/Treg 平衡的影響

喬小改

（鄭州大學第二附屬醫院產科，河南 鄭州 450000）

正常妊娠為一種成功的半同種異體移植現象，其前提是母胎之間正常的免疫耐受，這種耐受過程存在復雜精細的免疫調節，其中有多種諸如輔助性T細胞17(T helper cell17，Th17)和CD4+CD25+調節性 T 細胞（regulatory T cell，Treg）的免疫細胞參與[1,2]。近年來多篇文獻報道[3,4]不明原因復發性流產（unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA)與Th17/Treg失衡密切相關。脂聯素（adiponectin，APN）是一類由脂肪細胞分泌的激素蛋白，不僅參與非胰島素依賴型糖尿病 （non-insulin dependent diabetes，NIDD）、 冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（coronary atherosclerotic heart disease，CAHD）的發展,也與妊娠糖尿病、妊娠特發性脂肪肝、先兆子癇等妊娠并發癥的發生有一定關聯。相關研究發現[5]APN受體在試管嬰兒反復胚胎種植失敗者中呈低表達,提示APN信號缺乏可能導致妊娠失敗。Ramezani A等[6]的課題研究發現APN體外處理可改善自然流產者外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）的 Th17/Treg失衡。但目前尚未見到APN對自然流產模型小鼠妊娠結局及Th17/Treg失衡影響的相關研究報道,故本研究欲通過觀察APN對自然流產模型小鼠妊娠結局及Th17/Treg細胞分群的影響,為自然流產防治措施的研究提供參考,現將研究結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 經動物保護協會及醫學倫理委員會批準,選用購于上海南方模式生物科技股份有限公司,許可證號：SCXK（滬）2017-0010的 8~10周齡健康SPF級雄性BALB/c小鼠、雄性DBA/2小鼠、雌性CBA/J小鼠，平均體質量約25g。小鼠分籠飼養于動物實驗室獨立通氣籠中,實驗室室溫維持在22~25℃，濕度維持在50%~60%，采用同種無菌飼料對所有小鼠進行投喂，不限制飲水，每天光照12h，適應性喂養1周。

1.2 實驗試劑 小鼠脂聯素、轉化生長因子β（Transforming growth factor β，TGF-β）、白細胞介素 17（Interleukin17，IL-17）酶聯免疫吸附試劑盒購于美國TSZ;生理鹽水購于上海喬羽生物科技有限公司；脂聯素重組蛋白購于美國Amresco；PBS緩沖液購于常德比克曼生物科技有限公司；FITC-CD25單克隆抗體購于廣州健侖生物科技有限公司；FITC-IL-17A單克隆抗體購于美國eBioscience；布雷菲德菌素A（BFA）購于湖北欣欣佳麗生物科技有限公司；PE-Cy7-CD4單克隆抗體購于上海瑞齊生物科技有限公司；PE-FoxP3單克隆抗體購于上海微蒙生物公司；佛波酯（PMA）購于南京春秋生物工程有限公司；伊諾霉素（ionomycin）購于美國Sigma。

1.3 小鼠模型及給藥方式 適應性喂養1周后，將雌性CBA/J小鼠與雄性BALB/c小鼠合籠交配建立正常妊娠（Normal pregnancy，NP）模型（n=10），雌性CBA/J小鼠與雄性DBA/2小鼠合籠交配建立自然流產（spontaneous abortion，SA）模型（n=20），各小鼠合籠后，觀察陰栓，若發現陰栓則計為妊娠第0日，將雌性CBA/J小鼠與雄性BALB/c小鼠、雄性DBA/2小鼠隔離飼養。將20只SA模型小鼠采用隨機數字列表法分為脂聯素組 （APN組，n=10）和生理鹽水組（NS 組，n=10），妊娠第 5d，APN組 CBA/J孕鼠腹腔注射 10μg/（kg·d）重組脂聯素，1次/d，NP組和NS組CBA/J孕鼠腹腔注射等量生理鹽水。3組療程均為9 d。

1.4 評價指標

⑴脂聯素、IL-17、TGF-β 水平：CBA/J孕鼠眼球取血，2 419×g離心10 min，分離血清，采用酶聯免疫吸附法 (ELISA)檢測CBA/J孕鼠血清中脂聯素、IL-17、TGF-β、IL-17/TGF-β 水平。

⑵胚胎吸收率：療程結束,將CBA/J孕鼠處死，無菌狀態下打開腹腔，切開子宮，分離胚胎、胎盤等，將其與正常胚胎作比較，觀察胚胎大小、出血情況、吸收情況等，計數存活胚胎數和吸收胚胎數，計算胚胎吸收率。胚胎吸收率=吸收胚胎數/總胚胎數×100%。

⑶脾臟淋巴細胞中Th17、Treg比例：療程結束,將CBA/J孕鼠處死，無菌狀態下打開腹腔，分離CBA/J孕鼠脾臟，充分剪碎，制成勻漿液，用200目不銹鋼濾網過濾，分離獲得小鼠脾臟淋巴細胞，調整細胞懸液濃度為1×107/ml。取小鼠脾臟淋巴細胞懸液 200μl， 加入 0.05ng/L PGMEA、10 ng/L BFA、1mol/L伊諾霉素37℃孵育5 h，PBS漂洗，加入10μl PE-Cy7-CD4抗體，4℃避光孵育 0.5h，PBS漂洗，再加入10μl FITC-IL-17A抗體，4℃避光孵育0.5h，PBS緩沖液重懸細胞，采用流式細胞儀（美國貝克曼庫爾特，型號：CytoFLEX LX）檢測CD4+IL-17A+細胞占CD4+T淋巴細胞的比例。同上，取小鼠脾臟淋巴細胞懸液200μl，加入10μl FITCCD25抗體、10μl PE-Cy7-CD4抗體，4℃避光孵育0.5h，PBS漂洗，加入PE-FoxP3抗體，4℃避光孵育0.5h，PBS緩沖液重懸細胞，采用流式細胞儀檢測CD4+CD25+FoxP3+細胞占CD4+T淋巴細胞的比例。

1.5 統計學處理 采用spss22.0軟件進行統計分析。計量資料多組間比較采用單因素方差分析，其中兩兩比較采用SNK-q檢驗；計數資料比較采用卡方檢驗。P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組孕鼠妊娠結局 與NP組比較，NS組胚胎吸收率明顯升高（P<0.05）；與NS組比較，APN組胚胎吸收率明顯下降（P<0.05）；NP組、APN組胚胎吸收率相比,差異無統計學意義（P＞0.05）,見表 1。

表1 各組孕鼠胚胎吸收情況比較[n(%)]

2.2 各組孕鼠血清中脂聯素、IL-17、TGF-β、IL-17/TGF-β水平 與NP組比較，NS組血清中脂聯素、TGF-β 水平明顯下降（P<0.05），IL-17、IL-17/TGF-β水平明顯升高（P<0.05）；與NS組比較，APN組血清中脂聯素、TGF-β水平明顯升高（P<0.05），IL-17、IL-17/TGF-β 水平明顯下降 （P<0.05）；NP 組、APN 組血清中脂聯素、IL-17、TGF-β、IL-17/TGF-β 水平相比，差異無統計學意義（P＞0.05）,見表 2。

2.3 各組孕鼠脾臟淋巴細胞中Th17、Treg細胞分群 與NP組比較，NS組Th17/CD4+T細胞比例、Th17/Treg比值明顯升高 （P<0.05），Treg/CD4+T細胞比例明顯下降（P<0.05）；與NS組比較，APN組Th17/CD4+T細胞比例、Th17/Treg比值明顯下降（P<0.05）,Treg/CD4+T 細胞比例明顯升高(P<0.05)；NP組、APN組Th17/CD4+T細胞比例、Th17/Treg比值、Treg/CD4+T細胞比例相比,差異無統計學意義（P＞0.05）,見表 3。

表3 各組孕鼠脾臟淋巴細胞中Th17、Treg細胞分群比較（)

表3 各組孕鼠脾臟淋巴細胞中Th17、Treg細胞分群比較（)

與NP組比較,*P<0.05；與APN組比較,#P<0.05

組別 例數(只)NP組NS組APN組10 10 10 FP Th17/CD4+T細胞Treg/CD4+T細胞1.80±0.75 5.70±1.30*#2.05±0.90 46.687<0.001 6.59±1.51 3.79±0.40*#6.30±1.05 20.078<0.001 Th17/Treg 0.30±0.09 1.51±0.29*#0.33±0.25 92.351<0.001

3 討論

成功妊娠實際是成功的母胎免疫耐受，這種耐受過程中若出現Th17/Treg失衡，則容易發生復發性流產（recurrent spontaneous abortion，RSA）[3,4]。RSA是指反復的自發性流產，為妊娠期常見并發癥，約占妊娠人群的30%。現有的檢查手段能明確的病因包括內分泌異常、父母染色體異常（如平衡易位攜帶者）、母體子宮結構異常、自身免疫異常（如抗磷脂抗體綜合征），但仍存在40%RSA人群不能明確病因則定義為URSA。由于URSA病因不明，臨床對URSA干預的針對性欠佳，使其成為生殖領域的難點。多位學者[7,8]就URSA的治療進行研究發現利用第三方的淋巴細胞進行免疫治療或靜脈注射免疫球蛋白（Immunoglobulin，Ig）等療效一般，安全性也有待證實。因此，尋找有效治療方案對存在免疫耐受失敗風險人群有重要意義。

表2 各組孕鼠血清中脂聯素、IL-17、TGF-β、IL-17/TGF-β水平比較（)

表2 各組孕鼠血清中脂聯素、IL-17、TGF-β、IL-17/TGF-β水平比較（)

與NP組比較,*P<0.05；與APN組比較,#P<0.05

組別 例數(只)NP組NS組APN組10 10 10 FP脂聯素（ng/ml）12.79±0.58 3.38±0.19*#11.92±1.05 549.951<0.001 IL-17（pg/ml）33.62±2.49 137.49±11.29*#48.20±6.69 531.726<0.001 TGF-β（pg/ml）72.42±2.09 32.31±5.50*#68.28±7.29 166.348<0.001 IL-17/TGF-β 0.48±0.13 4.27±0.07*#0.69±0.3 1217.560<0.001

白色脂肪組織可分泌抵抗素、瘦素(leptin，LEP)、血管緊張素（Angiotensin）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、APN 等多種蛋白質，APN為脂肪細胞分泌的蛋白質中較為重要的一種[9]，其可參與整個妊娠過程，還能調控炎癥反應,并涉及對IG、細胞因子（如細胞刺激因子、白細胞介素、干擾素）、補體、人類白細胞抗原（Human leukocyte antigen,HLA）等免疫分子表達的影響[10]。相關文獻報道[11,12]APN還可調節Th17/Treg,在NID D、CAHD等疾病發生、發展過程中扮演重要角色。Zhu L等[13]發現正常妊娠者血清中APN水平明顯高于RSA患者,提示APN水平與妊娠結局（如URSA、胎兒早產或出生缺陷）密切相關。Wei-Hong L I等[14]進行體外試驗發現APN處理后URSA患者PBMC中Th17比例減少,CD4+CD25+調節性 T細胞比例上升,使Th17/Treg趨于正常,說明APN在妊娠過程中對Th17/Treg平衡有一定影響，而母胎之間正常的免疫耐受往往存在免疫調節,進一步提示APN可能可母胎免疫有關。CBA/J×DBA/2為經典的SA動物模型，孕鼠對胚胎的雄性抗原識別異常，從而產生異常的免疫應答可能為SA發生的主要機制。本研究中，NS組胚胎吸收率與NP組比較明顯升高，APN組胚胎吸收率與NS組比較明顯下降，結果與Fei W U等[15]人的報道基本相符，提示APN可有效改善SA小鼠胚胎吸收情況，減少不良妊娠結局。Th17、Treg為兩類重要的免疫細胞。Th17細胞是一種具有很強的促炎癥作用的能夠分泌IL-17的T細胞亞群,可參與系統性紅斑狼瘡(SLE)、自身免疫性溶血性貧血（AHA）、多發性腦脊髓硬化癥（MS）等自身免疫性疾病發生、發展，且與不良妊娠結局有密切關系[16]。而Treg是一類重要的具有促進母胎耐受、維持正常妊娠作用的免疫抑制細胞。一直以來，Th17/Treg平衡是生殖免疫耐受領域的研究熱點,為了進一步探討APN對SA作用機制,本研究采用流式細胞術檢測重組脂聯素對CBA/J孕鼠脾臟淋巴細胞中Th17/Treg分群的影響，結果顯示，NS組Th17/CD4+T細胞比例、Th17/Treg比值較NP組明顯升高，Treg/CD4+T細胞比例較NP組明顯下降；APN組Th17/CD4+T細胞比例、Th17/Treg比值較 NS 組明顯下降 （P＜0.05），Treg/CD4+T細胞比例較NS組明顯升高。因此，我們推測重組脂聯素可能通過調控脾臟淋巴細胞中失衡，影響母體對父系抗原特異性免疫耐受，從而使SA模型小鼠不良妊娠結局得以顯著改善。

綜上,重組脂聯素治療可能通過糾正Th17/Treg細胞失衡及相關細胞因子水平，改善SA模型小鼠的妊娠結局。但本研究造模數較少，有待擴大樣本作進一步研究。