聯合檢測外周血VEGF 和EMMPRIN mRNA 在肝癌轉移監測中的意義

沈學文 ，劉愛 ，鄔艷 ，劉靜 ，余曉慧

(1.寧波市奉化區中醫院消化科，浙江 寧波 315500；2.寧波市奉化區社區衛生服務中心，浙江 寧波315500；3.南昌市東湖區疾病預防控制中心，江西 南昌 330006；4.南昌大學第二附屬醫院檢驗科，江西 南昌330006；5.瑞昌市人民醫院檢驗科，江西九江332200)

原發性肝癌惡性程度高，惡化速度快，我國其發病率在各種惡性腫瘤中位居第二。外科手術是目前最有效的肝癌治療措施,但術后5年復發率卻可超過70%，因此肝癌預后極差[1]。國內外研究表明轉移和復發是影響肝癌患者生存率的主要因素,這與肝癌的高度血管浸潤及轉移傾向密切相關[2]。

肝癌轉移前期僅有少量癌細胞或癌細胞團存在于外周血液[3]，影像、病理等常規檢查方法不能發現，最近研究顯示，通過高度敏感、特異的基因檢測技術能檢測到肝癌早期轉移時血液中腫瘤相關基因的mRNA[4,5]，從而為肝癌的轉移和復發爭得寶貴的治療先機。

本研究通過檢測原發性肝癌患者外周靜脈血中游離的血管內皮生長因子 （vascular endothelial growth factor，VEGF）mRNA 和基質金屬蛋白酶誘導因子（extracellular matrix metalloproteinase inducer，EMMPRIN）mRNA，探索它們在肝癌早期轉移監測中的作用。

1 材料與方法

1.1 標本來源

1.1.1 收集本院2016年10月至2018年10月收治的16例經病理方法確診為原發性肝癌伴轉移的患者外周血5ml，以EDTA-2K抗凝，作為肝癌轉移組標本。患者年齡36～86歲，中位數年齡68.5歲，其中男11例，女5例；肝內轉移14例，肝外轉移2例。

1.1.2 收集同期經病理方法確診為原發性肝癌但無轉移的患者16例，抽取外周血5ml，以EDTA-2K抗凝，作為肝癌無轉移組標本。患者年齡31～89歲，中位數年齡63歲，其中男10例，女6例。

1.1.3 收集性別、年齡構成相仿的健康體檢者外周血16例，每例5ml，以EDTA-2K抗凝，作為健康對照組標本。

1.1.4 三組研究對象在性別、年齡構成等方面差異均無統計學意義。

1.2 方法

1.2.1 標本處理 上述新鮮血液樣本置4℃保存，48h內用Ficoll密度離心法分離單個核細胞，分離方法如下：以Hank’s液按1：1的比例稀釋全血標本，緩慢滴加到含Ficoll溶液的15ml離心管中，Ficoll和血液體積比為 1：2，400g，4℃離心 30min，用滴管吸取血清和Ficoll交界的單個核細胞層，以Hank’s液洗滌一次后用凍存液置于-80℃凍存。用Trizol試劑抽提細胞總RNA。檢測RNA質量后行逆轉錄合成cDNA。

1.2.2 熒光定量PCR檢測 VEGF基因擴增引物為, 上游：5′-GAT CGA GTA CTA CTT CAA GCC-3′, 下游：5′-TTG TTG TGC TGT AGG AGG C-3′；EMMPRIN基因擴增引物為，上游：5′-CCG GTC AGA GCT ACA CAT TGA-3′, 下游：5′-TCT TGC CTT TGT CAT TCT GGT-3′；反應結束后確認Real Time PCR的擴增曲線和熔解曲線；以GAPDH表達量為內參照標準，根據雙delta法計算各基因的相對表達量。

1.2.3 統計分析 Real Time PCR每次測定均設置3個復孔,結果以均數±標準差表示。數據以SPSS12.0進行分析,統計學分析方法為兩樣本均數t檢驗和四格表卡方檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 VEGF和EMMPRIN的相對表達情況 與健康對照組相比，VEGF和EMMPRIN在肝癌無轉移組和肝癌轉移組均顯著高表達，VEGF在兩組中的相對表達量分別為 2.44±0.47 和 5.78±0.41，EMMPRIN 為 4.21±1.06和 7.34±1.26。在健康對照組、肝癌無轉移組和肝癌轉移組,組間兩兩比較,VEGF和EMMPRIN表達量差異均有統計學意義,見圖1。

圖1 VEGF和EMMPRIN mRNA表達量

2.2 外周血VEGF和EMMPRIN mRNA監測肝癌轉移的評價 健康對照組與肝癌無轉移組、健康對照組與肝癌轉移組、肝癌無轉移組與肝癌轉移組中VEGF和EMMPRIN mRNA的表達經卡方檢驗P值均小于0.05，差異均有統計學意義。見表1。

表1 VEGF和EMMPRIN mRNA在各組中的表達情況

3 討論

肝臟腫瘤中肝細胞癌是典型的富血管的腫瘤,血管生成因子對腫瘤的生長和轉移有重要的調控作用，尤其是VEGF基因[6]。VEGF是一種選擇性血管內皮細胞有絲分裂原,是目前已知的最直接的血管生成活性蛋白,多數研究認為其表達水平增高可以促進腫瘤血管的增生,使腫瘤微血管密度增加，有利于腫瘤細胞的生長和轉移[7-8]。我們的研究顯示，在外周血中，與健康對照組相比，VEGF在肝癌組和轉移組均顯著高表達,并且轉移組的表達量還明顯高于無轉移組,這說明肝癌患者外周血中的VEGF水平可能對肝癌轉移具有一定的提示作用。但有文獻顯示，VEGF在正常人組織和血漿滲出液中均有低水平，且穩定的表達[9]，我們的研究也證實了這一點。因此，雖然VEGF在肝癌轉移檢測中具有較好的靈敏度，但其特異性稍顯不足。因此，本研究中我們同時檢測了肝癌患者外周血中的EMMPRIN基因的表達。

EMMPRIN，又稱CD147，為免疫球蛋白超家族成員之一,其可通過成纖維細胞刺激合成基質金屬蛋白酶，降解細胞外基質，促進腫瘤的浸潤與轉移[10],是當前侵襲與轉移機制中研究的熱點之一[11-12]。已有文獻證實其在肝癌組織中有較高的表達[13-15]，但有關其在肝癌患者循環血液中的表達研究還比較少。我們的研究顯示，EMMPRIN與VEGF在肝癌患者中的表達相類似，與健康對照組相比，其顯著高表達于肝癌組和肝癌轉移組。值得注意的是，EMMPRIN基因有很好的特異性，在本研究中的健康對照組中僅有一例陽性表達，當然，其特異性到底有多高還有待于更大樣本量的研究。

綜上所述,檢測肝癌患者外周血中VEGF mRNA對肝癌轉移監測的敏感度較高，而EMMPRIN mRNA的檢測對肝癌轉移監測又具有較好的特異度，因此聯合檢測肝癌患者外周血中VEGF和EMMPRIN mRNA對肝癌的早期轉移監測具有一定的應用價值。