γ干擾素釋放試驗在HIV合并TB感染中的應(yīng)用價值

邊澤源，楊云紅，吳芝煒，張齊龍，熊玉紅

（江西省胸科醫(yī)院檢驗科，江西 南昌 330006）

全球近3400萬HIV感染者中，有超過1/3合并感染TB（包括潛伏感染），HIV合并TB感染者結(jié)核發(fā)病率是單純TB感染者的30倍[1]。數(shù)據(jù)統(tǒng)計顯示，我國艾滋病患者中結(jié)核病的感染率達(dá)29.1%，結(jié)核病已經(jīng)成為艾滋病患者就診、入院和死亡的主要原因,嚴(yán)重影響到艾滋病患者的預(yù)后和生存質(zhì)量[2,3]。相比于非免疫缺陷者，HIV感染者更容易重新激活體內(nèi)潛伏性感染結(jié)核分枝桿菌并發(fā)展為彌漫性感染，病情迅速惡化甚至死亡[4,5]，因此早期診斷HIV合并TB感染、及時發(fā)現(xiàn)隱匿性TB，對控制HIV合并結(jié)核分枝桿菌感染、降低其住院率及病死率，具有重要意義。本研究回顧性分析四種TB診斷方法在HIV合并TB感染患者中的診斷價值，報告如下。

1 研究對象與方法

1.1 一般資料 收集2015年1月-2017年12月我院確診HIV合并TB感染的患者資料40例，男31例，女9例；年齡44.95±13.18歲。同期HIV未合并TB感染的患者資料40例,男29例,女11例；年齡45.9±15.31歲。艾滋病診斷符合艾滋病診療指南(2011版)的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]。肺結(jié)核均依據(jù)臨床表現(xiàn)，細(xì)菌學(xué)，影像學(xué)或抗結(jié)核藥物治療確診，診斷依據(jù)按照2005年中華醫(yī)學(xué)會《臨床診療手冊（結(jié)核病分冊）》診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]。

1.2 主要儀器與試劑 γ干擾素釋放試劑盒 （英國Oxford Immunotec Ltd.），人型結(jié)核菌素純蛋白衍生物試劑(Purified protein derivative，PPD)（北京祥瑞生物制品有限公司），結(jié)核分枝桿菌抗體檢測試劑盒（成都永安制藥有限公司）

1.3 方法

1.3.1 γ干擾素釋放試驗 采血前囑咐患者空腹8h以上，以含抗凝劑檸檬酸鈉的采血管采集肘靜脈血10ml，盡快分離單個核細(xì)胞(PBMC)，用細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞備用。將包被抗IFN-7抗體的微量板平衡至室溫,向4個孔中分別加入結(jié)核分枝桿菌特異混合多肽 A（含 ESAT-6）和 B（含 CFP-10），陰性對照細(xì)胞培養(yǎng)液，陽性對照植物血凝素(PHA)。然后，各孔分別加入含250 000個細(xì)胞的上述單個核細(xì)胞懸液。37℃培養(yǎng)16～20 h后，用PBS液洗板4次，各孔分別加入堿性磷酸酶標(biāo)記的小鼠抗人IFN單抗，2～8℃孵育1 h。取出后用PBS液洗板4次。各孔分別加入顯色底物液BCIP／NBTPLUS，室溫中靜置7 min后觀察結(jié)果。當(dāng)測試孔A或B達(dá)到以下標(biāo)準(zhǔn)則判定為陽性結(jié)果：⑴如果陰性對照孔斑點數(shù)為0～5個,測試孔斑點數(shù)減去陰性對照孔斑點數(shù)≥6。⑵如果陰性對照孔斑點數(shù)≥6個，測試孔斑點數(shù)必須≥2倍的陰性對照孔斑點數(shù)。注意：陽性對照孔不出現(xiàn)斑點，說明試驗不成功。

1.3.2 痰涂片找抗酸菌檢測 抗酸染色鏡檢嚴(yán)格按照中國防癆協(xié)會制定的 《結(jié)核病診斷實驗室檢驗規(guī)程》[8]進行。

1.3.3 結(jié)核分支桿菌素PPD 消毒皮膚，在左前臂背側(cè)上1/3處，皮內(nèi)注射5 U人型結(jié)核分支桿菌素純蛋白衍生物（Montous法，l：2 000)。 結(jié)果判斷按照《全國結(jié)核病防治工作手冊》規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)進行：在試驗72 h后，硬結(jié)平均直徑=(橫徑+縱徑)/2。硬結(jié)直徑≥5個者或有水皰、破潰者為PPD試驗陽性。無紅腫硬結(jié)者為陰性。

1.3.4 血清結(jié)核抗體檢測 采用結(jié)核分枝桿菌抗體檢測試劑盒進行分析,具體步驟及判斷方法嚴(yán)格按照說明書進行操作。

1.4 統(tǒng)汁方法 檢測結(jié)果均用陽性率表示,運用SPSS19.0統(tǒng)計軟件,采用配對χ2檢驗對各組陽性檢出率進行統(tǒng)計學(xué)分析,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 四種檢測方法在HIV合并TB患者中陽性檢出率的比較 40例HIV合并TB感染患者，γ干擾素釋放試驗診斷HIV合并TB感染敏感性為65.0%（26/40）、特異性為97.5%，其敏感性顯著優(yōu)于痰找抗酸桿菌 17.0%（7/40），PPD 15%(6/40)和結(jié)核抗體40.0%(16/40)(P＜0.05)。且γ干擾素釋放試驗在免疫嚴(yán)重抑制（CD4＜100/mm3）患者中敏感性＞60.0%。40例HIV未合并TB感染患者，γ干擾素釋放試驗假陽性2.5%(1/40)，而結(jié)核抗體假陽性率為 32.5%(13/40)。

2.2 CD4細(xì)胞計數(shù)水平對4種試驗陽性檢出率比較 按CD4細(xì)胞計數(shù)水平高低分為CD4＜100/m m3(17 例)，CD4(101～200)/mm3(15 例),CD4(201～500)/mm3(8 例)，CD4＞500/mm3(0 例)。γ 干擾素釋放試驗在各組陽性檢測率均高于其余3種試驗，且在免疫不同組中檢測陽性率無統(tǒng)計學(xué)差異。見表1。

表1 CD4細(xì)胞計數(shù)水平對4種試驗陽性檢出率的影響

3 討論

HIV合并肺結(jié)核分枝桿菌感染初期，臨床癥狀不典型，肺部影像學(xué)也難以判斷，傳統(tǒng)的痰涂片找抗酸桿菌和痰結(jié)核菌培養(yǎng)，仍是TB感染診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但涂片陽性率低，培養(yǎng)時間亦長，給結(jié)核病的早期診斷與治療帶來困難。γ干擾素釋放試驗（TB-interferon gamma release assay,TB-IGRA)是一種體外檢測TB致敏T淋巴細(xì)胞的結(jié)核感染診斷方法。該方法利用結(jié)核分枝桿菌特異性抗原作為刺激物，結(jié)合酶聯(lián)免疫技術(shù)的放大優(yōu)勢,研究報道對潛伏性TB感染的診斷具有較高的敏感性和特異性[9,10]。

本研究采用4種實驗對HIV合并TB感染患者進行檢測分析，結(jié)果顯示，TB-IGRA實驗的陽性率為65.0%，與李春夢等[11]報道的基本一致，明顯高于PPD試驗、結(jié)核抗體及痰涂片檢測結(jié)果。且在CD4細(xì)胞不同組陽性檢測率均高于其余3種方法，即使在免疫嚴(yán)重受抑制的患者中TB-IGRA檢測陽性率也達(dá)到60.0%。比較顯示,傳統(tǒng)的痰找抗酸桿菌、PPD試驗和結(jié)核抗體等方法在檢測HIV感染合并TB中均存在不同的局限性。尤其值得一提的是，由于我國大面積接種卡介苗，導(dǎo)致 PPD試驗存在假陽性，且對于HIV感染合并TB患者屬于免疫低下人群，也存在一定的假陰性率[12]。有研究表明HIV感染后細(xì)胞免疫應(yīng)答和變態(tài)反應(yīng)受到抑制，PPD試驗的陽性檢出率降低至15%～40%[13]。結(jié)核抗體常規(guī)檢測方法較復(fù)雜,并且也受到患者免疫力及抗原特異性的影響，對HIV合并TB患者診斷意義有限。痰涂片作為HIV合并肺結(jié)核分枝桿菌感染診斷和療效觀察最直接、簡便的檢驗方法，但其受標(biāo)本質(zhì)量，檢驗人員主觀影響大，漏檢率較高。劉艷等[14]報道，對HIV疑似感染分枝桿菌患者標(biāo)本139人份標(biāo)本進行直接涂片檢到的抗酸分枝桿菌僅9例；TB-IGRA主要檢測TB患者體內(nèi)存在特異的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞。當(dāng)這部分T淋巴細(xì)胞在體外再次受到結(jié)核桿菌特異抗原(ESAT-6與CF P-10)的刺激時，會分泌釋放 IFN-γ，因此，通過檢測IFN-γ的水平可以判斷機體是否存在結(jié)核感染[15]。雖然在HIV感染后導(dǎo)致 CD4+T細(xì)胞下降，但是 CD8+T細(xì)胞和 γδ+T細(xì)胞也可以少量分泌IFN-γ，所以即使免疫嚴(yán)重受抑制，仍不受影響。

綜上所述,TB-IGRA方法,由于其對結(jié)核診斷的高敏感性和高特異性，且不易受患者免疫狀態(tài)的影響，很受臨床醫(yī)生的青睞，短短幾年，已在臨床得到廣泛應(yīng)用，已成為臨床診斷結(jié)核的常規(guī)檢測方法。本文結(jié)果也顯示，TB-IGRA方法對早期診斷HIV患者合并TB感染明顯優(yōu)異傳統(tǒng)的實驗室檢測方法。