維生素D水平及其受體基因的多態性與女童中樞性性早熟關系的研究

鐘龍青 ，劉志強 ，楊利 ，劉發娣 ，柯江維

(江西省兒童醫院檢驗科，江西 南昌 330006)

維生素D(Vit D)又稱為骨化醇、抗佝僂病維生 素，是不同的Vit D原經紫線外照射后形成的脂溶性固醇類衍生物,也是一種類固醇激素[1],并由細胞內特異的Vit D受體(VDR)介導，發揮激素樣的生理特性。維生素D受體是介導有生物活性的維生素D發揮生物效應的核內生物大分子，屬于類固醇激素受體，其功能反映了活性維生素D的功能[2,3]。同時，研究發現 VDR 基因 ApaI， TaqI， BsmI和FokI的多態性與很多疾病的發生發展有著密切的關聯[4-6]。

Vit D與性激素（主要指雌二醇）同屬于類固醇激素，兩者之間是否具有交叉的生物學效應。目前尚無文獻報道。國外已有少數的文獻研究表明，VDR介導的Vit D信號途徑參與了兒童性腺的發育，Vit D水平及VDR基因可能與兒童性激素的分泌及性早熟有著密切的關聯，但沒有Vit D水平及VDR基因多態性與兒童性早熟相關性的研究。因此，本文將研究中樞性性早熟女童Vit D濃度變化及VDR基因多態性差異，以了解維生素D影響女童性早熟的部分機制。

1 材料和方法

1.1 研究對象及標本采集 選取2016年7月-201 6年9月期間在我院內分泌科住院或門診就診的臨床癥狀符合且經B超，骨齡攝片，CT，MRI及GnRHa激發試驗確認為中樞性性早熟[7]，并排外其他疾病的40例省內女童為病例組，年齡為7.90±0.67歲，并選取同期在我院兒保科進行體檢且身體健康的女童作為對照組，年齡為7.86±1.25歲。

1.2 實驗方法

1.2.1 標本采集 留取病例組與對照組患兒外周血4ml,其中2ml置于含乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管中，另外2ml置于普通管中，立即送檢，用化學發光技術檢測其血清25-OH Vit D的濃度。

1.2.2 外周血基因組DNA提取 將置于EDTA抗凝管中的2ml血,采用TIANGEN試劑盒提取DNA，-80℃保存備用。

1.2.3 引物設計與合成 委托上海生工生物工程技術有限公司合設計合成。

1.2.4 rs2228570，rs7975232，rs1544410，rs731236目的基因的擴增和多態性位點測序 先采用多重PCR進行擴增,之后進行SNaPshot多重單堿基延伸反應并將延伸產物純化后在ABI3730XL測序儀上測序,采用GeneMapper 4.1(AppliedBiosystems)進行分析。

1.3 統計學分析 用spss17.0進行統計學分析,基因型和等位基因頻率采用基因計數法計數,研究對象與Hardy-Weinberg平衡的符合程度、單個基因型及組間等位基因頻率比較采用四方格χ2檢驗,計量資料維生素D進行正態性檢驗，其呈偏態分布,采用秩和檢驗,P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 病例基本資料 該實驗納入中樞性性早熟女童40例，年齡(7.90±0.67)歲，正常健康女童40例，年齡(7.86±1.25)歲,兩組年齡無統計學差異(t=0.190，P=0.85)。

2.2 病例組和對照組血清中VitD測定 中樞性早熟患兒25-OH Vit D水平為 45.51(35.06，54.24)nmol/L,健康兒童25-OH Vit D水平為60.25(52.19，72.95)nmol/L，將其進行秩和檢驗發現兩組的差異有統計學意義(P<0.001)，見表1。

表1 中樞性性早熟和健康對照組25-OH Vit D水平

2.3 中樞性早熟患兒的發育年齡與血清中維生素D的水平進行相關性分析 發現中樞性早熟患兒的發育年齡與血清中維生素D的水平兩者之間無線性關系（P=0.561）。

2.4 中樞性性早熟和健康對照組25-OH Vit D各水平構成比 40例中樞性性早熟患兒中，有13例(32.5%)出現維生素D缺乏，13例(32.5%)出現維生素 D 不足(25-OH Vit D<50 nmol/L)，14例（35%）的維生素D水平正常。在健康對照組中,維生素D不足者有7例（17.5%），33例（82.5%）維生素D水平正常。維生素D不足的女童患中樞性性早熟的風險明顯提高（OR=8.755，95%可信區間為3.086~24.838）。 見表 2。

表2 中樞性性早熟和健康對照組25-OH Vit D各水平構成比

2.5 VDR基因多態性位點測序結果 將所提取的DNA送至上海生工生物工程技術有限公司用ABI 3730XL型測序儀進行SnapShot測序。測序所得VDR基因在兩組人群中的分布頻率,經Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗,達到遺傳平衡,具有群體代表性。

2.6 兩組間VDR基因多態性的比較 基因序列rs1544410(BsmI)的野生型為 CC，突變型為 CT、TT，中樞性性早熟組與正常對照組均未檢測到TT，基因型CC、CT在兩組中的分布差異無統計學意義(χ2=0.721，P=0.396)。 兩組基因型 CC和 CT的 OR和95%可信區間(CI)分別為1.056(0.931-1.197)和0.500(0.097-2.577)。基因序列rs2228570(FokI)的野生型為AA，突變型為GA、GG，此三種基因型在中樞性性早熟和正常對照組的分布差異無統計學意義(χ2=3.414，P=0.181)，等位基因 A、G 在兩組的分布差異也無統計學意義(χ2=2.633，P=0.105)。 基因序列rs731236(TaqI)的野生型為AA，突變型為GA、GG，兩組均未檢測到GG，基因型AA、GA在兩組中的分布差異無統計學意義(χ2=0.000,P=1.000)。基因序列rs7975232(ApaI)的野生型為CC，突變型為CA、AA，三種基因型在兩組的分布差異有統計學意義(χ2=9.833，P=0.007)。 等位基因 C、A 在兩組間的分布差異無統計學意義 (χ2=2.795，P=0.095)。見表3。

表3 中樞性性早熟組和對照組VDR基因多態性的比較

3 討論

性早熟是一種兒童生長發育異常的疾病，與兒童的正常生長發育周期相違背,影響兒童的身心健康并引起一系列社會經濟問題[8,9]。性早熟的發病機制錯綜復雜,是基因和環境共同影響作用的結果。自2008年,維生素D缺乏或不足引起公共衛生問題[10]被提出，維生素D逐漸成為人們研究的熱點。有研究表明維生素D可能與性早熟的發病有關。

目前有關維生素D與性早熟相關性的研究較少。國內唐家彥[11]等研究表明性早熟女童維生素D水平明顯低于對照組女童。國外Hae Sang Lee[12]等研究表明性早熟女童中,維生素D缺乏者的比例明顯高于正常女童。本文對40例性早熟女童和40例健康女童進行研究發現,中樞性性早熟女童維生素D水平低于健康女童,其維生素D不足者所占比例明顯高于正常對照組女童。中樞性性早熟女童中維生素D水平與其發育年齡進行相關性研究,發現兩者間無相關性，與國內外之前研究相符。

眾所周知，25-OH VitD必須通過與VDR結合才能發揮生物學效應。同時有研究表明維生素D代謝過程中所需的酶受VDR基因多態性的調節[13,14]。新近的研究表明：VDR的功能受VDR基因SNP的影響，且與多種疾病相關，在VDR眾多SNP位點中，研究較多的是 ApaI(rs7975232)、BsmI(rs1544410)、TaqI（rs731236）、FokI(rs2228570)。

目前有關VDR基因多態性與性早熟的研究也較少，國外學者Santos BR[15]2012年對36名性早熟兒童進行研究發現，VDR的ApaI多態性位點可以調節人體內雌激素的分泌與性早熟的發生有關，具體作用機制沒有闡明。本文采用SnaPshot方法對VDR的SNP位點，包括ApaI(rs7975232)、BsmI(rs1544410)、TaqI（rs731236）、FokI(rs2228570)進行檢測分析。實驗中發現中樞性性早熟組以及健康對照組的 BsmI(rs1544410)和 TaqI（rs731236）位點僅能檢測到野生型與雜合型兩種基因型,分別為CC、CT和AA、GA。中樞性性早熟組的基因型以及分布頻率分別為 CC(95%)、CT(5%)和 AA(90%)、GA(10%)，對照組的為 CC(90%)、CT(10%)和 AA(90%)、GA(10%)，各基因型在兩組的分布差異無統計學意義（χ2=0.721，P=0.396；χ2=0，P=1）。 等位基因 C、T和G、A在兩組中分布的差異也無統計學意義（χ2=0.693，P=0.405；Xχ2=0，P=1）， 提示這兩位點的多態性可能與性早熟的發病無關。FokI(rs2228570)位點在兩組中均存在三種基因型，中樞性性早熟組的基因型以及分布頻率分別為AA(12.5%)、GA(40%)、 GG(47.5%)， 對照組為 AA(17.5%)、 GA(55%)、GG(27.5%)，三種基因型在兩組的分布差異無統計學意義（χ2=3.414，P=0.181）。 對 G、A 兩等位基因進行分析，發現其在兩組的分布差異也無統計學意義（χ2=2.633，P=0.105）。提示多態性位點FokI可能與性早熟的發病無關。對于ApaI(rs7975 232)位點,兩組中均發現三種基因型 CC，CA，AA,其分布頻率分別為25%,70%,5%和55%,35%,10%,在兩組間的分布差異有統計學意義 （χ2=9.833，P=0.007）。這說明VDR的ApaI位點的多態性存在可能影響了性早熟的易感性。

綜上所述，我們推測ApaI(rs7975232)位點的突變可能影響了VDR基因mRNA3’末端非翻譯區，該區通過調控VDR蛋白質的合成，影響VDR蛋白的表達，從而影響患兒對性早熟的易感性。結合前期研究發現維生素D水平影響性早熟的發病率，而維生素D的生物活性作用需要VDR介導，推測可能維生素D是通過影響VDR的ApaI位點的多態性起作用的。其作用機制值得進一步研究。