白細胞介素-23通過Smad4調控間充質干細胞成骨分化的機制研究

張放 孫怡蕓 梁曉倩 楊爽

1976 年Friedenstein 等［1］首次證實骨髓中存在間充質干細胞（mesenchymal stem cells, MSC），發現其可以作為壁龕細胞對造血干細胞發揮支持和輔助的作用。隨著研究的深入，MSC 被證實為人體內重要的多能干細胞，主要存在于機體多種結締組織，不僅具有低免疫原性的特點，還具有強大的免疫調節和多向分化功能［2］。近年來研究顯示，MSC 是人體內成骨細胞的主要來源，可作為組織工程與修復醫學的種子細胞，廣泛應用于骨折修復、組織重建等再生醫學領域［3，4］。然而，在實際應用中卻發現，MSC移植后在體內定向分化效率較低，限制了MSC的臨床應用［5］。如何進一步提高MSC 成骨分化效率，從而推動其臨床應用，是當前研究的重點與熱點。

MSC成骨分化受到多種炎癥因子的調控［6］。白細胞介素23（interleukin-23,IL-23）屬于IL-12家族中的一類促炎因子，主要由巨噬細胞和樹突狀細胞產生，發揮調控多種T細胞分化、增殖的功能［7］。已有研究發現，IL-12家族中多個因子對MSC的功能有重要的調控作用，但IL-23 對MSC 功能影響的研究較少［8］。在本研究中，我們擬在體外探討IL-23對MSC成骨分化功能的調控作用，探索提高MSC分化效率的方法。

材料與方法

一、主要材料與儀器

H-DMEM 培養基、0.25%胰蛋白酶-EDTA（Gibco，美國）；胎牛血清（杭州四季青，中國）；PBS 緩沖液、Percoll分離液、RIPA蛋白裂解液、蛋白定量試劑盒、氯仿、異丙醇、無水乙醇、多聚甲醛、焦碳酸二乙酯（DEPC）水（碧云天公司，中國）；地塞米松、β-磷酸甘油、抗壞血酸、氯化十六烷基吡啶（CPC）、茜素紅（Sigma，美國）；堿性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性檢測試劑盒（南京建成生物，中國）；IL-23（R&D，美國）；cDNA 逆轉錄試劑盒、SYBR Green 熒光定量試劑盒（TAKARA，日本）；Trizol提取液、全基因組表達譜芯片、Lipo 2000 轉染試劑盒（Life，美國）；siRNA（吉瑪基因，中國）；CD14-PE、CD45-FITC、HLA-DR-PE、CD29-FITC、CD44-PE、CD105-FITC 抗體（Meltenyi，德國）；離心管（15 ml、50 ml）、6孔板、96孔板、25 cm2培養瓶（Corning，美國），移液器（Eppendorf，德國）。生物安全柜、CO2恒溫培養箱、酶標儀、低溫高速離心機、Nano 分光光度計、PCR 儀（Thermo Fisher，美國）；Roche480 熒光定量PCR儀（Roche，美國）；倒置相差顯微鏡（Olympus，日本）；Hybridization Oven、Fluidics Station、GeneChip Scanner 3000（Affymetrix，美國），均用于芯片雜交與檢測。

二、MSC體外分離、培養

8周齡的C57BL/6J小鼠購自遼寧省實驗動物公共服務平臺，本研究動物實驗均符合動物實驗倫理規范。所有小鼠均采取頸椎脫臼法處死，處死后解剖、切除雙側股骨，用10 ml PBS 緩沖液沖洗股骨骨髓腔，將骨髓沖入離心管中。骨髓樣本用注射器緩慢加入等量Percoll分離液（1.073 g/ml）于液面上，以2 000 r/min 離心30 min。用巴氏吸管吸取中間白膜層并用PBS 緩沖液洗滌1 次，用含10%胎牛血清的H-DMEM 培養基重懸后以2×106cells/cm2的密度接種于25 cm2培養瓶中，放置于37 ℃、5%CO2細胞培養箱中培養。72 h后洗去未貼壁細胞，此后每3 d換液1 次。當細胞達到80%～90%融合時，0.25%胰蛋白酶-EDTA 消化傳代，第2～3 代細胞用于進行下一步實驗。

三、流式細胞術

MSC 分離培養3 d 后，常規消化收集細胞，通過計數法調整至濃度為1×106/ml，加入對應流式抗體10 μl，于室溫下避光孵育30 min。隨后用PBS 緩沖液清洗離心，通過流式細胞儀分析相應細胞表面標志物表達。

四、成骨分化誘導與刺激

MSC 以1×105cells/孔的密度接種于6 孔板，待細胞完全貼壁后換為成骨誘導培養基（含10%胎牛血清、50 mg/L 抗壞血酸、10 mmol/L β-磷酸甘油、10 nmol/L 地塞米松的H-DMEM），此后每3 d 換液1 次。實驗組培養基中添加不同濃度IL-23（0、10、50、100 μg/L）持續刺激。

五、ALP活性測定

MSC誘導至10 d后，棄去上清，用PBS緩沖液輕輕清洗3 次，每孔加入RIPA 蛋白裂解液100 μl，冰上放置30 min。隨后吸取蛋白裂解液，于4 ℃下以12 000 r/min 離心30 min。按照試劑盒方法配置ALP反應液，于96孔板中每孔加入反應液100 μl，同時加入蛋白上清30 μl，37 ℃孵育15 min。隨后每孔加入顯色液150 μl，充分混勻后通過酶標儀測吸光度。部分離心后的蛋白上清通過BCA 蛋白濃度試劑盒測定蛋白濃度，經蛋白標準化定量后樣品的ALP活性單位為U·（g pro）-1·（15 min）-1。

六、茜素紅染色與定量分析

MSC誘導至14 d后，棄去上清，用PBS緩沖液輕輕清洗3 次，隨后用4%多聚甲醛溶液固定10 min。再次用PBS緩沖液清洗3次，吸干后每孔加入pH=4的1%茜素紅染色液1 ml，室溫孵育15 min。隨后用PBS 緩沖液洗去非特異性染色與雜質，于倒置相差顯微鏡下選取中心區域拍照記錄。拍照完成后，每孔加入1 ml 的10%CPC 萃取液，室溫萃取1 h。混勻吸取200 μl 置入96 孔板中，于酶標儀下測定吸光度。

七、RNA提取與逆轉錄

MSC 刺激誘導10 d 后，用PBS 緩沖液輕輕清洗3 次。每孔加入1 ml Trizol，于冰上孵育5 min。將裂解液轉移至EP管中并三氯甲烷200 μl，劇烈震蕩混勻后靜置5 min，隨后12 000 r/min離心15 min。離心后吸取上層水相液體并轉移入新的EP 管中。每管加入異丙醇500 μl，室溫靜置10 min 后12 000 r/min離心10 min。棄去上清，加入75%乙醇1 ml 洗滌RNA 沉淀，7 500 r/min 離心5 min。棄去上清，加入20 μl DEPC水。于Nanodrop紫外分光光度計下檢測RNA濃度與純度。按照逆轉錄試劑盒方法，每管加入逆轉錄試劑2 μl、RNA 8 μl，于37 ℃孵育15 min。

八、全基因組表達譜芯片

逆轉錄完成的cDNA 經過標記、芯片雜交、清洗、染色、掃描，收集數據后采用AGCC軟件（Affymetrix，美國）進行分析，實驗方法按照文獻［6］報道方案進行。

九、熒光定量PCR

EP管中分別加入cDNA 2 μl、引物0.2 μl、DEPC水2.8 μl、SYBR Green 5 μl，總體積為10 μl，充分混勻后加入96孔板中。將PCR反應板置入Roche 480熒光定量PCR儀中進行PCR反應，通過軟件分析數據基因相對表達量。內參GAPDH引物：GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT、GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG；IL-23 引物：CTCAGGGACAACAGTCAGTTC、ACAGGGCTATCAGGGAGCA；Smad4 引物：CTCATGTGATCTATGCCCGTC、AGGTGATACAACTCGTTCGTAGT。

十、siRNA干擾

根據Smad4 序列設計3 個siRNA 序列，通過PCR法驗證并選擇干擾效率最高的siRNA序列。將20 pmol的siRNA溶于50 μl DMEM培養基中。另將1 μl Lipo 2000 轉染試劑溶于50 μl DMEM 培養基中，混勻后于37 ℃孵育10 min。隨后將兩管試劑混勻孵育20 min，加入對應孔板中，于培養箱中孵育6 h。干擾后用PBS 緩沖液清洗3 次，加入新的培養基繼續培養。Smad4 的干擾序列為GCCAGCAGCTTT-CACAGAA；對照（NC）序列為AGTTGGCTAATTCCGGCCATT。轉染后分別為誘導組（成骨誘導、未轉染序列）、NC組（成骨誘導并轉染了NC序列）、siRNA 組（成骨誘導并轉染了干擾序列），使用IL-23（100 μg/L）對誘導組、NC 組、siRNA 組持續刺激10 d，并進行茜素紅及ALP實驗。

十一、統計學分析

采用SPSS 13.0軟件（IBM公司，美國）進行統計分析，數據以均數±標準差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD 法，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

結 果

一、MSC的形態與表型鑒定

MSCs呈梭型、成纖維細胞樣生長。流式細胞學檢測結果提示MSC 表型為CD14、CD45、HLA-DR 為陰性，CD29、CD44、CD105 為陽性，符合MSC 特征（圖1）。

二、IL-23促進MSC成骨分化

MSC 分別在不同濃度IL-23 刺激下誘導分化。茜素紅結果顯示隨著IL-23濃度增高（0～100 μg/L），茜素紅染色深度逐漸增加，鏡下可見MSC所形成的鈣結節數量和面積均顯著增加。通過CPC 萃取實驗，我們發現隨著IL-23濃度提高，其吸光度也相應增高，與未刺激組（0 μg/L）對比，差異具有統計學意義（P＜0.05），這與茜素紅染色結果一致。堿性磷酸酶實驗結果提示，隨著IL-23濃度提高，MSC 中堿性磷酸酶活性明顯上升，與未刺激組（0 μg/L）對比，差異具有統計學意義（P＜0.05）。這些結果均提示不同濃度的IL-23 均可以顯著刺激MSC 成骨分化（圖2）。

圖1 MSC 的形態與表型鑒定 a：MSC 呈梭型集落樣貼壁生長；b：流式細胞學分析結果提示MSC 為CD29、CD44、CD105 陽性，CD14、CD45、HLA-DR陰性，符合國際干細胞協會鑒定標準

三、IL-23上調Smad4表達

通過全基因組表達譜芯片，我們對不同濃度IL-23 刺激下成骨分化第10 天的MSC 全基因組進行檢測，發現IL-23 刺激后MSC 基因表達譜出現顯著異常，共有差異基因682 個。我們進一步對這些差異基因進行KEGG 信號通路分析，結果發現差異最顯著的前三位通路分別是BMP/Smad 信號通路（P＜0.001）、MAPK 信號通路（P=0.001）和Hedgehog 信號通路（P=0.014）。我們對BMP/Smad 信號通路進行分析，發現富集到該通路的差異表達基因有11 個，其中表達變化最顯著的基因為Smad4。我們進一步通過熒光定量PCR 對Smad4 的表達進行研究，結果提示隨著IL-23 濃度升高（0～100 μg/L），Smad4 的表達也隨之顯著上調（P＜0.05），與芯片的結果一致（圖3）。

四、干擾Smad4 表達可以抑制IL-23 促進MSC成骨分化

為了探討Smad4 在IL-23 促進MSC 成骨分化中的作用，我們設計了siRNA 對MSC 進行轉染，并使用IL-23（100 μg/L）對誘導組、NC 組、siRNA 組進行持續刺激。干擾MSC 的Smad4表達后，茜素紅結果顯示siRNA組染色較NC組明顯變淡，鏡下可見鈣結節數量明顯減少，且茜素紅定量結果明顯降低（P＜0.05）。此外，ALP 實驗結果提示siRNA 組MSC ALP活性水平較NC 組明顯降低，與茜素紅實驗結果一致（P＜0.05）（圖4）。

圖2 IL-23促進MSC成骨分化結果 a：茜素紅染色結果示不同濃度IL-23刺激下茜素紅染色逐漸加深；b：茜素紅定量結果提示吸光度隨著IL-23濃度增加而升高（與0 μg/L組對比，*P＜0.05）；c：ALP活性結果提示隨著IL-23刺激濃度增高，MSC成骨分化后ALP活性明顯增加（與0 μg/L組對比，*P＜0.05）

圖3 IL-23上調Smad4表達結果 a：全基因表達譜芯片提示，IL-23刺激后MSC基因表達譜出現明顯改變；b：熒光定量PCR結果提示Smad4表達量隨著濃度上升而增高（與0 μg/L組對比，*P＜0.05）

圖4 干擾Smad4表達后MSC成骨分化結果 在IL-23刺激情況下，干擾Smad4表達組的茜素紅染色顯著淡于單純誘導組和NC轉染組（a），茜素紅定量結果（b）及ALP結果（c）提示干擾Smad4表達后MSC成骨分化能力顯著下調（與誘導組對比，*P＜0.05）

討 論

MSC 是人體內重要的多能干細胞，廣泛存在于體內多種結締組織中，以骨髓中含量最為豐富［9］。研究顯示，MSC 主要三類功能：①支持造血。MSC可以作為骨髓微環境的壁龕細胞，一方面發揮支持造血干細胞的作用，另一方面可以分泌血小板衍生生長因子（platelet derived growth factor, PDGF）等多種因子，從而調控造血干細胞的增殖、分化等功能，發揮對人體內造血系統的調控［10］。②免疫調節。MSC 可以通過接觸抑制或者分泌IL-6、轉化生長因子β（transforming growth factor,TGF-β）等炎性因子，對機體內T 細胞、B 細胞、NK 細胞等多種免疫細胞發揮調控作用，從而維持機體內免疫穩態［11-13］。③多向分化功能。MSC 為中胚層來源細胞，在體外誘導環境下可分化為成骨細胞、成軟骨細胞、成脂肪細胞［14］。新近研究指出，MSC 是人體內成骨細胞的主要來源之一，MSC 正常成骨分化能力是維持機體內骨代謝平衡的重要因素，而MSC成骨分化異常則會導致骨質疏松等骨代謝疾病［3］。因此，深入研究MSC 成骨分化的機制，有助于闡明機體骨骼生長發育的具體機制，同時有助于揭示骨代謝異常疾病的發病機制。此外，MSC 具有低免疫原性的特點，其低表達或不表達MHC I類分子，不表達MHC Ⅱ類分子，同時也不表達共刺激分子，不具備激發免疫應答的活性，具有良好的臨床應用能力［4］。近年來，國內外學者已利用MSC 的成骨分化功能開展多項臨床應用研究，證實MSC可以作為組織工程與再生醫學的種子細胞，應用于骨折修復等疾病的治療［15］。然而，部分學者的研究也發現，臨床應用中MSC 的成骨分化受到多種細胞因子的影響和調控，其中炎性因子是影響體內MSC 成骨分化的主要因素之一［6］。研究證實炎性因子在體內作為“雙刃劍”調控MSC的成骨分化：當炎性因子處在正常水平范圍內，則可以調控MSC正常成骨分化，從而維持人體的骨代謝平衡；當體內炎性因子紊亂時，則會過度促進或抑制MSC 成骨分化，從而引起異位骨化或骨質疏松，導致疾病發生發展［16］。IL-23 是人體內重要的炎性因子，在體內發揮調控Th17細胞分化、增殖的功能［7］。研究發現，在強直性脊柱炎等疾病病人體內IL-23水平明顯升高，與病人病理性成骨密切相關，提示IL-23水平升高可能參與正性促進成骨的作用，但IL-23具體如何調控成骨細胞主要來源——MSC 的分化，目前相關研究不多［17］。闡明IL-23 調控成骨分化的機制，將有助于闡明多種相關疾病骨代謝異常的發病機制。除此之外，骨折術后不愈合、脊柱手術術后不融合等也是困擾當前骨外科醫師的重要并發癥，這主要是由于術后局部炎性微環境紊亂等因素所引起［18］。已有部分學者將MSC 作為種子細胞移植治療骨折不愈合、脊柱術后不融合等骨科疾病，但MSC 分化效率仍較低，闡明IL-23 調控MSC 成骨分化的機制，也將有助于提高MSC 的分化效率，促進和推動MSC的臨床應用。

在本實驗中，我們發現隨著IL-23 濃度升高，茜素紅染色與定量及ALP 結果均顯著上升，這從定性和定量兩方面均證實，IL-23可以顯著促進MSC成骨分化，且這種效應隨著濃度升高而提升。為了進一步探討IL-23 調控MSC 成骨分化的機制，我們對MSC 的全基因表達譜進行分析，KEGG 信號通路分析結果發現BMP/Smad 信號通路差異最為明顯，而其中成骨分化關鍵基因Smad4顯著上調。Smad4是BMP/Smad信號通路關鍵的中介分子，主要通過與磷酸化的Smad2/3或Smad1/5/8結合，介導入核調控相關成骨基因的轉錄，從而促進MSC 的成骨分化［19］。在本研究中，我們進一步通過熒光定量PCR技術證實IL-23可以顯著上調Smad4表達，且隨著濃度增加而效果升高，這與茜素紅及ALP 結果一致。此外，我們通過siRNA 干擾Smad4 表達，發現抑制MSC 的Smad4 表達后，最高濃度的IL-23（100 μg/L）的刺激也無法促進MSC 成骨分化，這一結果提示IL-23 確是通過Smad4 以調控MSC 成骨分化的。既往已有許多研究提示Smad4 是MSC 成骨分化的正性調控分子，而炎性因子可以通過上調Smad4 以促進MSC的成骨分化［20］。本研究結果證實，IL-23刺激正是通過上調MSC的Smad4表達，從而正性調控MSC的成骨分化。我們推測，在疾病模型中，可以通過抑制BMP/Smad 通路信號，從而阻斷IL-23 引起的異位骨化；而在臨床應用中，也可以通過IL-23對MSC進行預刺激，從而提高MSC 成骨分化能力，促進MSC 的臨床骨修復功能。

綜上所述，我們研究證實IL-23通過上調Smad4表達以促進MSC 成骨分化。但本研究中仍有一些不足，如IL-23在體內如何影響MSC功能，IL-23是否對MSC 成脂分化、免疫調節等功能發揮影響，IL-23對人來源的MSC 是否具有相同的作用？這些問題仍需在未來的研究中繼續解答。