顯微CT設定不同閾值范圍對評價生物活性玻璃在體內成骨結果的影響

胡騰龍 楊柳 頡強

生物活性玻璃是一種硅酸鹽類人工植骨材料，具有良好的成骨性能和生物力學性能，植入體內后彈性模量與人體骨骼相似且穩定，并且其很多產品已應用于臨床，是目前研究較多的植骨材料［1-3］。在分析生物活性玻璃成骨效果時，顯微CT是常用的手段之一［4］。

顯微CT 能夠反應植骨材料植入體內后的三維特點，且分辨率高，能夠捕捉到細致的影像學變化。顯微CT 結果的影響因素主要有：感興趣區域（region of interest,ROI）的類型、ROI 選取部位、分割閾值、顯微CT 分辨率［5，6］。本研究通過選用不同的閾值范圍計算生物活性玻璃的成骨結果，比較不同閾值范圍得出的成骨結果的差異，并通過與組織學對比研究，以選取合適的閾值分割范圍，為采用顯微CT有效評價植骨材料成骨效果奠定實驗基礎。

材料與方法

一、生物活性玻璃的制備

本實驗所使用生物活性玻璃是直徑為6 mm，高為8 mm 的圓柱體，主要成分為CaO、SiO2、Na2O、P2O5、MgO 以及少量的CaF2，孔隙率體積百分數為20%～80%，孔徑范圍為50～600 μm。該材料為空軍軍醫大學西京醫院骨科與美國諾邦生物制品有限公司共同研究生產。

二、動物實驗

本研究中所進行的動物實驗均由空軍軍醫大學西京醫院倫理委員會批準。選用6 只SD 雄性新西蘭大白兔（購自空軍軍醫大學動物實驗中心），兔齡為4～5 個月，平均體重為3 kg。每只新西蘭大白兔隨機選擇一側股骨髁放置實驗材料。

手術時，采用動物麻醉藥陸眠寧及3%的戊巴比妥溶液肌肉注射進行麻醉，麻醉成功后，暴露股骨髁部，擺好體位，消毒鋪單。放置材料時，沿著股骨縱軸切開皮膚，分離皮下組織及骨膜，完整顯露出整個股骨髁，用與材料相同直徑的電鉆從髁部外側向內側鉆孔，深度與材料高度相同。然后將無菌的生物活性玻璃植入骨缺損處，放置骨蠟固定材料，逐層縫合髁部切口，術后常規抗感染治療。

三、顯微CT分析

術后3個月，將6只動物安樂死后完整取出植骨材料，保持其外形，放置于標本管中，顯微CT（eXplore Locus SP型，GE公司，美國）進行掃描。三維重建處理軟件（Microview V2.1.2，GE 公司，美國）以合適參數重建標本，建立實驗需要的ROI。Advanced Bone Analysis（ABA）骨骼分析軟件（GE 公司，美國）采用不同閾值分割范圍分別代表新生骨及剩余材料（表1），6 只動物所取標本各掃描一次，掃描后每個標本采用6種不同閾值范圍分別重建6次，并根據閾值范圍的不同分為A、B、C、D、E、F 組，作為實驗組，計算每組材料內的新生骨體積百分比（bone volume/total volume, BV/TV），分析新骨的生成及骨長入情況。同時計算出剩余材料的體積百分比（RMVF），RMVF=剩余材料的體積/材料總體積×100%，分析植入體內材料3個月內的降解情況。

表1 實驗組各個分組的閾值分割范圍

四、組織學分析

所有micro-CT 掃描過的材料，梯度酒精脫水處理（70%、90%和100%），聚丙烯酸甲醋（PMMA）包埋后，用硬組織切片機（Reichert-Jung, Leica SP1600，德國）垂直于材料縱軸進行切割，得到材料圓形界面，研磨拋光后進行Van Gieson 染色（Sigm-Aldrich，美國），放置于光學顯微鏡下觀察并隨機獲取圖像，隨機選取6例樣本中的不同斷層來計算結果，用Image-Pro Plus（IPP）5.1圖像分析軟件（Media Cybernetics 公司，美國）對切片的新生骨面積百分比進行測量和分析，作為對照組。

五、統計學分析

采用SPSS 16.0統計學軟件（IBM公司，美國）進行統計分析，所有數據均用均數±標準差（x±s）表示，實驗組顯微CT 不同閾值成骨結果之間的比較，采用ANOVA 方差分析；顯微CT 不同閾值實驗組成骨結果與對照組組織學結果之間的比較，采用相關性分析進行統計學分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、顯微CT結果

如圖1所示，紅色為新生骨組織，藍色為剩余材料，藍色剩余材料能保持圓柱形形態，植骨材料植入股骨髁的內側成骨較外側多，且成骨多從植骨材料圓柱形表面開始，隨著時間的延長，逐漸向植骨材料圓柱形中心延伸。通過計算，新骨生成量隨閾值范圍不同逐漸變化，A組新骨生成量最少，逐漸增大，F組新骨生成量最大（圖2 a，表2），6組成骨結果之間的差異具有統計學意義（F=16.690，P＜0.001）。剩余材料的體積比也隨閾值范圍不同逐漸變化，A 組最大，逐漸減小，F 組最小（圖2 b，表2），6 組剩余材料體積比之間的差異也具有統計學意義（F=16.07，P＜0.001）。

二、組織學結果

組織學結果見圖3，圖3 a為16倍鏡下材料的整體圓柱面，仍保持其原有形狀，黑色部分代表生物活性玻璃材料，白色為材料孔隙，紅色部分為新骨，均勻分布在材料內部。圖3 b為100倍鏡下，藍色部分為纖維組織，紅色部分為新生成骨組織染色，使用IPP 軟件統計分析，對照組新生骨占總面積的百分比為21.33%±1.25%。通過相關性分析，結果顯示，實驗組A 與對照組呈正相關，相關系數為0.2，P＜0.05；實驗組B 與對照組呈正相關，相關系數為0.2，P＜0.05；實驗組C 與對照組呈正相關，相關系數為0.867，P＜0.05；實驗組D 與對照組呈正相關，相關系數為0.2，P＜0.05；實驗組E 與對照組呈負相關，相關系數為-0.067，P＜0.05；實驗組F與對照組呈正相關，相關系數為0.333，P＜0.05。實驗組C 與對照組之間的相關性最高。

表2 實驗組閾值分割后的骨體積分數及剩余材料的體積分數

圖1 不同閾值范圍分割植骨材料的三維重建 a、b：A組；c、d：B組；e、f：C組；g、h：D組；i、j：E組；k、l：F組

圖2 實驗各組CT掃描結果 a：各組的新生骨體積百分比（BV/TV）；b：各組的剩余材料體積百分比

圖3 組織學結果 a：顯微鏡下材料的橫斷面（Van Gieson染色，×16）；b：顯微鏡下材料的橫截面（Van Gieson染色，×100）

討 論

顯微CT能觀察標本的三維結構，能從不同層面及角度觀察新骨生成情況，對植骨材料成骨能力的分析有著不可替代的作用［7］。尤其是在分析生物活性玻璃成骨及降解性能時，有與其他材料不同之處。生物活性玻璃能與骨組織形成羥基磷灰石層，顯微CT可采用不同閾值將其分割加以區分，能更好地判斷生物活性玻璃的成骨活性［8］。顯微CT 還能判斷成骨集中部位及快速降解區域，為我們準確判斷材料成骨及降解性能，并判斷其他生物學性能及生物力學性能提供幫助。畢龍等［9］建議在采用顯微CT分析骨修復效果和骨強度時，只采用單閾值分析會將不成熟的骨組織或其他與骨組織閾值相近的成分（如羥基磷灰石等）當成骨組織進行分析，因此會得出錯誤的判斷及結果，為了更好地評價骨折愈合效果，采用多閾值分析技術更加準確［10］，因此顯微CT 在骨科基礎實驗研究中尤其是骨形成的研究中發揮著重要作用。如果閾值范圍選擇錯誤，會造成成骨結果的錯誤判斷，直接導致后面的各種無效分析，尤其是在對成骨材料生物活性玻璃的分析中，不僅無法對成骨能力進行分析，其降解性能及形成羥基磷灰石、纖維組織的能力也無法進行正確評估。所以選擇合適的閾值對實驗結果尤為重要。

本次實驗，我們采用不同閾值范圍分析材料植入兔體后新生骨組織與剩余材料結果，實驗組采用方差分析后，A 組至F 組新骨生成結果及材料降解結果均具有顯著差異，表明采用不同閾值范圍分析生物活性玻璃新骨生成結果及生物活性玻璃材料降解結果影響較大，不能為我們提供準確有效的判斷，突出了閾值范圍選擇的重要性。

組織學切片是判斷新生骨的金標準，因此需要比較組織學結果，通過找到與組織學結果相符合的閾值范圍，來確定顯微CT 的最佳閾值范圍。而通過相關性分析后，C 組的閾值范圍（骨組織1 200～2 700、剩余材料≥2 700）分析的生物玻璃新骨生成結果，與組織學結果最為接近，兩組之間關聯性最高，我們認為C 組代表新骨生成及剩余材料百分比的閾值范圍最為準確，將生物活性玻璃材料的閾值確定為2 700 以上，同時根據顯微CT 的類型及結合其他研究分析骨組織的閾值范圍，確定骨組織的閾值范圍為1 200～2 700。可利用C 組閾值范圍對其余指標（骨小梁厚度、數量、連接密度等）進行進一步的分析測量。顯微CT 最大的優勢是能進行空間內部三維結構特征的分析，同時能對被檢測對象進行“量”與“質”各種變化的精確測量，而組織切片則能幫助我們對標本局部的細胞形態和生長發育變化進行更為微觀層面的解釋［11］。在分析骨形成時兩者結合不僅能保證實驗結果的準確，更能使我們從微觀至局部及整體多個方向、不同層面進行評價，更加完美地反映新生骨的形態、結構及分布的特點［12］。

本次實驗僅說明了閾值選擇的重要性，未做進一步詳細研究。但在實際應用當中，應當注意不同閾值的選擇對實驗結果的影響，尤其是在對成骨材料成骨性能的判斷上，要結合組織病理學結果、顯微CT類型，準確判斷，避免假陽性實驗結果。