軟骨仿生環境下的培養在軟骨組織工程中的研究進展

袁禮波 綜述 徐永清 審校

（1.昆明醫科大學；2.中國人民解放軍聯勤保障部隊第九二〇醫院，云南 昆明 650032）

關節軟骨為透明軟骨，富有彈性，摩擦因數小，能吸收關節間振蕩，是維持關節功能的重要結構，臨床上因多種原因導致的關節軟骨缺損的發病率很高，由于關節軟骨中無神經、血管，自愈能力較差，因此，關節軟骨自身修復能力有限，即使是小的關節軟骨損傷也可能導致關節軟骨退行性病變[1]。目前的治療方法如軟骨移植、微骨折等已經被廣泛的應用于關節軟骨的損傷修復[2]，但是，研究結果顯示，這些方法都存在一些技術上的局限性，均不能實現長期的軟骨修復。此外，關節軟骨自我損傷的修復部位主要由纖維軟骨填充而不是透明軟骨，其最終結局還是修復部位軟骨的退化壞死，因此，組織工程在軟骨再生方面具有很大的發展潛力。多種種子細胞均可誘導出軟骨細胞，但在軟骨組織工程中，從正常組織中分離得到的種子細胞在不同的物理、化學等條件下，得到的細胞差異較大，主要表現在種子細胞擴增培養后與天然軟骨組織的匹配度、修復區力學強度不同等，這些復雜的因素均困擾著軟骨組織工程的發展和應用。因此，歸納分析目前已知的各種對軟骨體外培養產生影響的因素，并展望一個行之有效的組合方法，通過仿生環境的研究進一步推進組織工程在軟骨修復研究中的發展方向。

一、種子細胞

軟骨組織工程的是將少量活組織作為種子細胞，將其體外培養擴增后并植入病損部位，以達到損傷修復和功能重建的目的，其包括三大要素：成軟骨相關種子細胞、信號分子、支架材料等。

目前研究較多的種子細胞包括骨髓間充質干細胞、肌肉干細胞、干細胞衍生的外泌體(stem cell-derived exosomes，SC-Exos)、脂肪干細胞、胚胎干細胞等,多種種子細胞均可誘導生成接近正常軟骨的細胞，但與培養過程中的多種因素相關，且差異較大。最新研究[3-5]發現，干細胞并不是直接增殖、分化成軟骨組織，而更可能是通過旁分泌形式分泌細胞外囊泡的方式發揮功能，SC-Exos可以誘導周圍細胞發生遺傳變化，并起調節作用，如促進其增殖或抑制細胞凋亡。以上研究說明，若SC-Exos在軟骨缺損部位保持其有效濃度，可促進軟骨細胞增殖，從而持續有效地修復和再生軟骨組織。

二、生長因子

探索出對細胞增殖有調節作用的細胞因子已經成為骨軟骨組織工程的重要環節。骨形態發生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)、轉化生長因子（transforming growth factor，TGF）、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、胰島素樣生長因子等在骨軟骨缺損的修復過程中發揮了重要作用。其中，BMP-2成骨潛力巨大，是促進骨骼再生的關鍵因素，An G等[6]制備明膠/聚乳酸-羥基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid，PLGA)納米復合支架并將VEGF和BMP加載在支架中，使生長因子在修復骨軟骨缺損可以持續釋放，結果顯示，VEGF和BMP可以促進BMSCs在支架上的黏附、增殖和分化。趙丹丹等[7]獲取人骨髓間充質干細胞（human bone marrow-derived mesenchymal stem cells,hBMSCs）后，分別用DMEM和DMEM+堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor,bFGF） 培養基進行培養。DMEM+bFGF培養體系下的細胞形態、細胞得率及成軟骨能力等方面均優于DMEM組。DMEM+bFGF培養體系下，按照1∶3傳代的細胞傳至第6代仍能維持較好的細胞形態；第1～4代細胞均表達軟骨特異性細胞外基質Ⅱ型膠原，第5及后續代次的細胞成軟骨能力較差。此外，蔣萍等[8]發現Ⅱ型膠原蛋白包被培養板在培養軟骨細胞時更能維持細胞形態，延長去分化現象出現的時間，更利于細胞再分化。康健等[9]發現富血小板凝膠萃取液中 PDGF-AB、TGF-β1、IGF-1、VEGF 生長因子濃度明顯高于全血，富血小板凝膠與軟骨細胞復合培養，軟骨細胞增殖速度明顯高于普通培養軟骨細胞。由此可見在體內，細胞的新陳代謝和功能的發揮時刻受到來自微環境的信息調控，包括來自周圍細胞、細胞外基質或因子中的生化信息、生物力學和生物電刺激信號等[10]，因此出現了共培養的概念，其初衷是在體外環境下模擬體內細胞微環境，促進細胞間信息交換和功能仿生組織的生成，但是，軟骨組織工程共培養系統中細胞間相互作用的具體機制仍不清楚。介于多種生長因子的不同作用機理，可認為只應用一種或少數生長因子往往達不到多方位同時促進軟骨向正常軟骨生長的目的，只有不斷模仿正常生物的體內環境，才能增加軟骨體外培養的滿意度。

三、載體

目前用于組織工程支架的材料主要有天然生物材料、人工合成高分子材料和復合材料3大類。單純應用天然生物材料或人工合成高分子材料存在諸多問題，如生物力學不足及免疫反應等；將兩種或兩種以上具有互補特性的材料進行復合，并選擇合適的制備工藝，可以設計構造出能夠滿足軟骨組織工程所需的三維支架。而三維支架的研究仍處于初級階段，從已有研究文獻報道的支架類型從結構上大致分為以下三類，單相支架、雙相支架、復合多相一體化支架。其中骨-軟骨一體化的單相支架又可同時修復軟骨與軟骨下骨，如段平國等[11]用一體化雙層聚乳酸/羥基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA)多孔支架材料，采用室溫模壓/粒子浸出法制備一體化雙層多孔支架，8周后見支架上層纖維組織中夾雜有少量軟骨細胞，下層可見大量骨小梁樣組織形成，上下層組織緊密結合，支架部分降解。鹿亮等[12]用豬軟骨細胞接種至脫細胞軟骨細胞外基質（acellular cartilage extra cellular matrix，ACECM） 取向支架，體外構建組織工程軟骨，再將軟骨細胞-支架復合物植入裸鼠背部皮下腔隙，術后4周，大體觀察見復合物呈類軟骨樣組織，組織學染色及Ⅱ型膠原免疫組織化學染色示細胞周圍軟骨細胞外基質分泌，可見ACECM取向支架有利于軟骨細胞的黏附、增殖及取向性分布類似于正常軟骨結構，并在裸鼠皮下成功異位構建組織工程軟骨。鄧天政等[13]制備了明膠-硫酸軟骨素-透明質酸及明膠-陶瓷化骨-軟骨復合多相支架，發現兔軟骨細胞在復合支架上生長良好，但該方法的不足是其產生的微孔大小難以控制。Yang X等[14]將氧化的海藻酸鹽作為大分子交聯劑制備膠原水凝膠支架，結果顯示乳兔關節軟骨細胞在交聯的膠原水凝膠支架上生長良好，并保持細胞表型，但該技術的不足是所制備的支架強度不高，并且常因吸水而變形，不能很好地促進細胞增殖。李建偉等[15]以豬源脫細胞軟骨細胞外基質、納米級羥基磷灰石和海藻酸鈉為原材料，按不同成分比例混合，利用冷凍干燥技術和物理化學法交聯，制備出以脫細胞軟骨細胞外基質為軟骨層，海藻酸鈉和脫細胞軟骨細胞外基質為中間層，納米級羥基磷灰石、海藻酸鈉和脫細胞軟骨細胞外基質為骨層的骨軟骨一體化多相支架，實驗結果顯示該骨-軟骨一體化多相支架具有良好的生物學與力學特性，但需要進一步的動物實驗觀察修復效果。這些相對傳統的方法在制備由多種材料不同結構的各相層組成的非均相支架方面仍存在缺陷。近年來，采用3D打印技術制備多孔隙支架已成為研究熱門，3D打印可精確定制外形和尺寸符合需要的植入體。運用3D打印技術制備的支架材料，不僅外形可控，其內部孔隙結構、大小、分布亦簡單易調，而且支架材料的組合自由多樣，可以實現骨與軟骨組織在結構和組份上的高度模擬。此外，3D生物打印技術也帶來了組織工程領域內新的一場技術革命，能夠將細胞和生物材料作為生物打印墨水，精確復制目標組織生理結構。

四、其他影響因素

在適當的時間范圍內施以適當的壓力可以促進單層培養的軟骨細胞增殖和基質的分泌，而超過一定的限度則會產生抑制的作用。Falsafi S等[16]研究發現軟骨細胞在微重力狀態下能迅速增殖，在短時間內分裂達較高的數量級別，克服了常規的培養時間長、增殖慢的缺點。氣體環境對軟骨細胞培養的影響早就被人們所認識，骨髓間充質干細胞向軟骨細胞誘導時也不例外。趙螢等[17]采用成軟骨誘導液培養同時每天給予120kPa壓力刺激1h，4周后采用Electro Force systems 3200力學測量儀測量其彈性模量，發現壓力作用下的骨髓間充質干細胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)復合富血小板纖維蛋白(platelet-rich fibrin,PRF)雙膜復合體所構建的組織工程軟骨其彈性模量較其他組更接近天然軟骨。此外，使用外源性機械壓力作用于移植的軟骨細胞及其基質，可以使用靜水壓力[18]和動態壓縮[19]方法改善基質成熟和新組織功能。但人在步行過程中，作用于人膝蓋軟骨的壓力是人體質量的4～5倍，而軟骨細胞是通過增殖和產生細胞外基質來應對高機械負荷。因此軟骨組織工程中關鍵之一在于找到合適的力學載荷;既要滿足組織代謝和傳質的要求;又要模擬關節運動,對軟骨產生適當的、耦合的力學載荷和生化刺激,促進工程軟骨的功能化構建，有研究發現氧濃度過高、過低都不利于軟骨細胞生長、繁殖及代謝，但具體氧濃度高低難以提出具體的數值，總而言之，僅僅提供這些條件尚未能滿足軟骨細胞維持正常生長的需求[20]，因為各因素對組織工程軟骨生物學效應的具體機制仍不清楚，因此體外仿生環境下模擬體內細胞微循環的培養系統的提出，是需要不斷深入的研究方向。

五、總結

在組織工程軟骨體外培養過程中，種子細胞、生長因子、營養物質與代謝產物、溫度、酸堿環境、氧分壓、CO2濃度等各種生化因素的變化都會造成培養條件的改變，進而影響軟骨體外構建的結果，而這些理化條件、應力及支架材料等各因素之間又相互聯系，相互影響，共同作用于工程軟骨，因此，在軟骨組織工程體外構建過程中需要充分考慮各因素之間的關系，包括力學載荷、生化刺激之間的協同作用或拮抗作用等，以進一步營造仿生培養環境。