神經絲蛋白輕鏈多肽在神經纖維瘤病變組織中的表達及意義

牛學強，劉 洋，劉福云，胡偉明

神經纖維瘤(Neurofibromatosis，NF)是一種常染色體線性遺傳病，腫瘤成分主要由雪旺氏細胞、周神經細胞和成纖維樣細胞等組成，細胞外間隙由大量膠原纖維沉積，根據臨床表現及基因型定位分為NF1和NF2兩種亞型[1]。I型神經纖維瘤(neurofibromatosis type 1，NF1)是臨床上一種神經皮膚綜合征，目前臨床多以手術治療、放化療等手段進行治療，但無法徹底治愈[2]。因此尋找NF1發生發展中的標志性生物分子，研究NFI發生發展機制對患者靶向治療具有重要意義。神經絲輕鏈多肽(neurofilament light-chain polypeptide，NEFL)是細胞骨架的關鍵成分，可與細胞塑形相關蛋白發生聯系發生作用[3]。研究報道，NEFL特異表達于神經組織，其異常表達或甲基化變異與腓骨肌萎縮并、脫髓鞘疾病等多種運動神經元疾病及腫瘤有關，但表達機制尚不清楚，另NEFL與NF1的關系尚鮮有研究[4～6]。因此本研究擬檢測NF1瘤變組織中NEFL表達水平，以探究其臨床意義，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析2017年1月～2019年6月本院收治的I型神經纖維瘤(NF1)患者34例為研究對象，收集手術或病理活檢切除的神經纖維瘤瘤變組織，患者年齡范圍不限，男性16例，女性18例。另取因整容或其他皮膚疾病手術患者術中切除的正常皮膚組織34例，患者年齡與神經纖維瘤患者相匹配，男性15例，女性19例。兩組患者年齡、性別比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。納入標準：(1)符合I型神經纖維瘤的診斷標準，皮膚可見6個或以上牛奶咖啡斑，形狀大小不一；(2)存在2個或兩個以上神經纖維瘤或從狀神經纖維瘤；(3)自愿參加本次調查研究。排除標準：(1)合并其他惡性腫瘤者；(2)臨床資料不完整者。本研究經過本院道德倫理委員會批準通過，所有樣品采集及資料調查均取得患者及其家屬知情同意并簽字確認，符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》。

1.2 主要試劑及儀器 Trizol試劑(貨號：R0016，上海碧云天)；PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit(編號：6210A)、TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)(編號：RR820A)購自TaKaRa生物公司；引物由上海吉瑪生物科技有限公司合成；蛋白抽提試劑盒(批號：P0028)、BCA蛋白定量試劑盒(批號：P0010S)，購自上海碧云天有限公司；一抗兔源NEFL(貨號：ab223343)、CTGF(貨號：ab231824)、TGF-β1(貨號：ab92486)、β-actin(貨號：ab8227) 抗體購自英國Abcam公司；二抗羊抗鼠IgG，羊抗兔IgG(貨號分別為B-2752，15135，美國Invitrogen)，紫外分光光度計(美國 Thermo 公司) 、RT-qPCR儀7500(美國Bio-Rad公司)、MODEL550型酶標儀等。

1.3 方法

1.3.1 NEFL、CTGF、TGF-β1 mRNA水平檢測 采用Trizol提取NF1瘤變及正常皮膚組織總RNA，用紫外分光光度計檢測總 RNA 濃度及純度。反轉錄得到cDNA，置于-20 ℃保存備用。采用(real-time quantitative PCR，RT-qPCR)檢測NEFL、CTGF、TGF-β1 mRNA表達水平。RT-qPCR采用20μl反應體系：TB Green Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)(2×) 10 μl，ROX Reference Dye or Dye II(50×)0.4 μl，cDNA(50 ng/μl)2 μl，上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μl，ddH2O 6.0 μl。反應采用兩步法，條件設置為：95 ℃，30 s；95 ℃，5 s；60 ℃，34 s，40個循環；添加溶解曲線。NEFL上游引物序列(5’→3’)為：GAA GAG GAG GCA GCT GGA AGA，下游引物序列(5’→3’)為：AAG GAA ATG GGG GTT CAA TC；CTGF上游引物序列(5’→3’)為：AAC TAT GAT TAG AGC CAA CTG CCT G，下游引物序列(5’→3’)為：TCA TGC CAT GTC TCC GTA CAT CTT C；TGF-β1上游引物序列(5’→3’)為：CTT CAG CTC CAC AGA GAA GAA GAA CTG C，下游引物序列(5’→3’)為：CAC GAT GAT GTT GGA CAA CTG CTC C； 內參β-actin上游引物序列(5’→3’)為：GTC GAT GGC TAG TCG TAG CAT CGA T，下游引物序列(5’→3’)為：TGC TAG CTG GCA TGC CCG ATC GAT C。采用2-△△CT法對NF1瘤變及正常皮膚組織中NEFL、CTGF、TGF-β1 mRNA的相對表達水平進行定量分析。

1.3.2 NEFL、CTGF、TGF-β1蛋白水平檢測 采用蛋白抽提試劑盒提NF1瘤變及正常皮膚組織總蛋白，BCA試劑盒檢測蛋白濃度，置于-80 ℃保存備用。取60 mg蛋白樣品，于80 mV電壓下6%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯凝膠酰胺(SDS-PAGE)電泳2 h，250 mA下PVDF膜轉膜70 min。采用含5%脫脂奶粉的磷酸鹽緩沖液(PBS)室溫封閉 2 h，加入適量含2%脫脂奶粉的PBS稀釋，加一抗(NEFL、CTGF、TGF-β1抗體 1∶500；GAPDH抗體 1∶500)4 ℃孵育過夜，TBST 緩沖液洗膜 3 次，每次 20 min，用適量含2%脫脂奶粉的PBS稀釋辣根過氧化物酶標記的二抗IgG(1∶5000)室溫孵育 1.5 h，按上述方法洗膜，用免疫印記化學發光試劑(ECL)顯色，數字化多功能圖像增強化學發光系統曝片，觀察結果并進行分析。

2 結 果

2.1 NEFL mRNA及蛋白在NF1瘤變組織及正常組織表達情況比較 與正常皮膚組織比較，NF1瘤變組織中NEFL mRNA及蛋白表達水平均顯著增加，差異有統計學意義(P>0.05)(見圖1，表1)。

2.2 CTGF和TGF-β1 mRNA及蛋白在NF1瘤變組織及正常組織表達情況比較 與正常皮膚組織比較，NF1瘤變組織中CTGF和TGF-β1 mRNA及蛋白表達水平均顯著增加，差異有統計學意義(P>0.05)(見圖2、表2)。

2.3 NF1患者瘤變組織中NEFL蛋白表達水平與CTGF、TGF-β1蛋白水平的相關性 Pearson相關性分析結果顯示，NF1患者瘤變組織中NEFL蛋白表達水平與CTGF、TGF-β1蛋白水平均正相關(r=0.471、0.610，P<0.05)(見圖3)。

A：正常皮膚組織；B：NF1瘤變組織

A：正常皮膚組織；B：NF1瘤變組織

圖2 WB檢測NF1瘤變組織及正常組織中CTGF和TGF-β1蛋白表達

左圖：NEFL與CTGF蛋白表達水平的相關性；右圖：NEFL與TGF-β1蛋白表達水平的相關性

圖3 NF1患者瘤變組織中NEFL蛋白表達水平與CTGF、TGF-β1蛋白水平的相關性

表1 NEFL mRNA及蛋白在NF1瘤變組織及正常組織表達情況比較

表2 CTGF和TGF-β1 mRNA及蛋白在NF1瘤變組織及正常組織表達情況比較

3 討 論

神經纖維絲包括NEFL、神經絲中鏈多肽及神經絲重鏈多肽3個亞型，其中NEFL是唯一可以自我組裝的亞單位，大量表達于軸突白質中，在維持神經細胞形態及使有髓鞘的軸突再生方面發揮重要作用[7]。NEFL編碼基因位于常染色體8p21，這一區域富含抑癌基因，且此區域是與多種癌癥發生機制有關的基因失雜合性多發區[8，9]。李全春等[10]研究報道，NEFL在軸索中高表達，神經元損傷后，NEFL進入細胞外液，導致顱腦損傷患者血清NEFL水平顯著高于正常對照組，且不良預后組血清NEFL水平高于預后良好組。研究報道[11，12]，NEFL在腦膠質瘤多形性細胞瘤組織及細胞中均顯著下調，是miR-183、miR-25的直接靶基因，可通過mTOR信號通路促進腦膠質瘤多形性細胞瘤細胞的增殖和侵襲。Sainio等[13]研究報道，早期發作的神經病年腓骨肌萎縮病患者的特異性神經元內缺乏NEFL。本研究結果發現，與正常皮膚組織比較，NF1瘤變組織中NEFL mRNA及蛋白水平均顯著升高，推測NEFL正常情況下特異表達于神經組織，在皮膚組織中幾乎無表達，瘤變組織NEFL異常增加可能與NF1發生有關。

神經纖維瘤發源于雪旺氏細胞NF1基因的突變、缺失或不表達，NF1基因異常不僅導致細胞本身的癌化，還可使組織中神經纖維素濃度降低，導致神經細胞及其它細胞間微環境失衡，破壞雪旺氏細胞與肥大細胞的負反饋機制，引起肥大細胞向腫瘤組織遷移并分泌轉化生長因子-β(Transforming growth factor-beta，TGF-β1)，促進纖維母細胞增殖，導致組織纖維沉積增加[14，15]。神經纖維瘤的病理顯示有大量梭形細胞和成纖維樣細胞等沉積，結蹄組織生長因子(Connective tissue growth factor，CTGF)是主要致纖維化因子和TGF-β1的直接下游效應分子，可促進成纖維細胞增殖、細胞外基質沉積，刺激膠原合成[16，17]。余文林等[18]研究報道，NF組織中CTGF、TGF-β1 mRNA水平及蛋白陽性表達率均顯著高于瘢痕疙瘩及正常皮膚組織，可促進神經纖維瘤發生發展。本研究結果發現，CTGF和TGF-β1 mRNA及蛋白在NF1瘤變組織中表達水平均高于正常皮膚組織，且與NEFL呈正相關，提示NEFL可能通過纖維化作用，與NF1發生發展有關。

綜上所述，NEFL在I型神經纖維瘤組織中高表達，可能通過組織纖維化參與NF1發生發展。由于此病發病率低，樣本采集不易，本研究納入患者較少，可能結果具有局限性，另關于NEFL參與NF1發生發展的具體作用機制及相關作用分子及通路尚不清楚，有待進一步深入探究。