內服結腸散的質量控制方法研究

吳艷蓉

內服結腸散為我院臨床應用廣泛、療效顯著的特色中藥制劑，由黃芪、浙貝母、川貝母、海螵蛸、茯苓、延胡索(醋制)、白芍和甘草八味中藥組成，具有益氣健脾，理氣止瀉之功效，廣泛用于慢性結腸炎、過敏性結腸炎、慢性腹泄、腸痙攣等癥的治療。目前，該品種的質量標準僅限于性狀、顯微鑒別和薄層鑒別，尚無含量測定的質量控制方法。該研究旨在建立其有效成分的HPLC含量測定方法，更好地對該品種進行質量控制。方中黃芪為君藥。黃芪甲苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷是黃芪藥材中的重要活性成分，《中華人民共和國藥典》2015版也以二者為含量測定的成分[1]。因此，本實驗選擇黃芪甲苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷為指標，建立HPLC含量測定方法，作為內服結腸散質量控制的依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器島津高效液相色譜儀(LC-10AT VP)，AnaStar 色譜工作站；電子天平(上海精天電子儀器有限公司，FA1104)。

1.2 試藥甲醇、乙腈(色譜純，山東禹王實業有限公司化工分公司)，正丁醇、氫氧化銨(天津市恒興化學試劑制造有限公司)，純凈水(杭州哇哈哈集團)。黃芪甲苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號110781-01616，純度為97.4%)，毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號110920-201304，純度大于97.1%)，內服結腸散(5 g/袋，批號20180413)及陰性樣品均由沈陽市肛腸醫院制劑室提供。

2 方法與結果

2.1 黃芪甲苷的含量測定

2.1.1 色譜條件與系統適用性試驗色譜柱：Diamosil C18色譜柱(200 mm×4.6 mm, 5 μm，迪馬公司)；流動相：乙腈-水(34：66，v/v)；流速：1.0 ml·min-1；檢測波長：200 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μl。分別取對照品、供試品和陰性對照品溶液適量，按以上色譜條件測定并記錄色譜圖，詳見圖1。理論塔板數按黃芪甲苷峰計算不低于4000，與相鄰峰的分離度大于1.5，系統適用性良好。

1.黃芪甲苷圖1 黃芪甲苷對照品(A)、陰性對照品(B)和樣品(C)的HPLC色譜圖

2.1.2 溶液制備對照品溶液：精密稱取黃芪甲苷對照品1.0 mg，置于10 ml量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，制成濃度為0.1 mg·ml-1的對照品溶液。供試品溶液：取內服結腸散5 g，加正丁醇50 ml，超聲處理30 min，濾過，濾液用氨試液洗滌2次，每次30 ml，棄去氨試液，用正丁醇飽和的水洗滌2次，每次30 ml，棄去水液，取正丁醇液蒸干，加入甲醇使殘渣溶解，并轉移至10 ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過備用。陰性對照溶液：按內服結腸散處方工藝制備缺少黃芪的陰性樣品，按照供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.1.3 方法學考察線性關系：精密稱取黃芪甲苷對照品適量，加甲醇分別制成濃度為0.02、0.05、0.1、0.2、0.4 mg·ml-1的對照品溶液。分別精密吸取以上各濃度的對照品溶液20μl注入高效液相色譜儀。以質量濃度(x)為橫坐標，以黃芪甲苷的峰面積(y)為縱坐標繪制標準曲線，經計算得到線性回歸方程為y=128140x+771.61，相關系數r=0.999 8(n=5)，表明黃芪甲苷的質量濃度在0.02～0.4 mg·ml-1范圍內與峰面積具有良好的線性關系。精密度試驗：精密吸取同一對照品溶液，按“2.1.1”項規定的色譜條件重復進樣6次，每次20μl，記錄黃芪甲苷峰面積，計算RSD為1.1%(n=6)，表明精密度符合要求。穩定性試驗：精密吸取同一供試品溶液，分別在第0、1、2、4、8、12 h按“2.1.1”項色譜條件進樣分析，每次20 μl，記錄黃芪甲苷峰面積，計算RSD為1.7%(n=6)，表明供試品溶液在12 h內穩定。重復性試驗：精密稱取內服結腸散6份各5.0 g，分別按“2.1.2”項方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項色譜條件進樣分析，記錄黃芪甲苷峰面積，計算RSD為1.5%(n=6)，表明重復性良好。加樣回收試驗：取已知含量的內服結腸散(批號20180413)6份，精密稱定，分別加入高、中、低三種濃度的對照品溶液適量，按“2.1.2”項下方法配制成供試品溶液，按“2.1.1”項色譜條件進行測定，結果平均回收率為101.12%，RSD=0.78%(n=6)。結果見表1。

表1 黃芪甲苷加樣回收率試驗結果 (n=6)

2.1.4 樣品中黃芪甲苷含量測定結果精密稱取內服結腸散樣品，按“2.1.2”項操作配制供試品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進行測定，計算黃芪甲苷的含量為0.1687 mg·g-1。

2.2 毛蕊異黃酮葡萄糖苷的測定

2.2.1 色譜條件與系統適用性試驗色譜柱：Topsil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm，Welch)；以乙腈(A)-0.2%甲酸(B)為流動相[1]，按表2所列條件進行梯度洗脫。流速：1.0 ml·min-1；檢測波長：260 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μl。取上述3種溶液適量，按以上色譜條件測定并記錄色譜圖，詳見圖2。理論塔板數按毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰計算不低于3000，與相鄰峰的分離度大于1.5，系統適用性良好。

表2 梯度洗脫條件

1.毛蕊異黃酮葡萄糖苷圖2 毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品(A)、陰性對照品(B)和樣品(C)的HPLC色譜圖

2.2.2 溶液制備對照品溶液：取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品1.0 mg，精密稱定，置于10 ml量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，制成濃度為0.1 mg·ml-1的對照品溶液。供試品溶液：取內服結腸散5 g，精密加入甲醇50 ml，稱定重量，加熱回流3 h，放冷，搖勻，濾過，精密量取濾液20 ml，蒸干溶劑，殘渣加甲醇使溶解，并轉移至5 ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過備用。陰性對照溶液：按內服結腸散處方工藝制備缺少黃芪的陰性樣品，按照供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.2.3 方法學考察線性關系：精密稱取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品適量，加甲醇分別制成濃度為0.02、0.05、0.1、0.2、0.4 mg·ml-1的對照品溶液，分別精密吸取以上各濃度的對照品溶液20 μl注入高效液相色譜儀。以質量濃度為橫坐標(x)，以毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰面積為縱坐標(y )繪制標準曲線，經計算得到線性回歸方程為y=263079x+3509.8，相關系數r=0.9997(n=5)，表明毛蕊異黃酮葡萄糖苷的質量濃度在0.02～0.4 mg·ml-1范圍內與峰面積呈良好的線性關系。精密度試驗：精密吸取同一對照品溶液，按“2.2.1”項規定的色譜條件重復進樣6次，記錄毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰面積，計算RSD為1.4%(n=6)，表明精密度符合要求。穩定性試驗：精密吸取同一供試品溶液，分別在第0、1、2、4、8、12 h按“2.2.1”項色譜條件進樣分析，記錄毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰面積，計算RSD為0.9%(n=6)，結果表明供試品溶液在12 h內穩定。重復性試驗：精密稱取內服結腸散6份各5.0 g，分別按“2.2.2”項方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項色譜條件進樣分析，記錄毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰面積，計算RSD為1.1%(n=6)，表明重復性良好。加樣回收試驗:取已知含量的內服結腸散(批號20180413)6份，精密稱定，分別加入高、中、低三種濃度的對照品溶液適量，按“2.2.2”項下方法配制成供試品溶液，在“2.2.1”項色譜條件進行測定，結果平均回收率為100.73%，RSD=0.81%(n=6)。結果見表3。

表3 毛蕊異黃酮葡糖苷加樣回收率試驗結果 (n=6)

2.2.4 樣品測定結果精密稱取內服結腸散樣品，按“2.2.2”項操作配制供試品溶液，在“2.2.1”項色譜條件下進行測定，計算毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量為0.0846 mg·g-1。

3 討論

內服結腸散方中以黃芪為君藥。現代化學和藥理學研究表明，黃芪藥材中主要含有皂苷類、黃酮及其苷類和多糖成分[2]。黃芪甲苷是黃芪質量評價的傳統指標[3]。黃酮類成分中以毛蕊異黃酮的含量和活性較高[4]，《中華人民共和國藥典》(一部)2015版亦以二者為黃芪藥材的含量測定指標[1]，因此，該研究以黃芪甲苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷為指標，建立內服結腸散的含量測定方法。

由于黃芪甲苷的最大紫外吸收波長在200 nm左右，可通過紫外檢測器進行測定，且紫外檢測器是HPLC法中較為常用的檢測器。因此，結合我院實際，在參考有關文獻[5]的基礎上，該研究選用紫外檢測器用于測定黃芪甲苷的含量。

該研究參考了羅堃、劉富英、陳莉和劉桂花等人的文獻報道[3，6～8]和2015版《中華人民共和國藥典》(一部)黃芪藥材項下毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量測定方法，對流動相進行了篩選，可滿足樣品中毛蕊異黃酮葡萄糖苷分離的要求。

該研究以HPLC法測定黃芪甲苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量，得到樣品整體分離效果良好，陰性對照無干擾，方法簡便靈敏，為內服結腸散的全面質量控制提供了科學依據，豐富和提高了醫院中藥制劑的質量控制標準，有助于實現醫院中藥制劑的現代化研究，推進中藥制劑的安全、有效、可控的良性發展[9,10]。