Th17/Treg及其相關(guān)炎性介質(zhì)在重癥膿毒癥中的表達(dá)機(jī)制研究

文明祥 孫鴻鵬 潘渝 梅華鮮 葉八寧 施賢清

（貴州省人民醫(yī)院 貴州 貴陽(yáng) 550002）

重癥膿毒癥是由感染所引起的全身炎癥反應(yīng)所引發(fā)的疾病，由于其發(fā)病過程中容易導(dǎo)致患者體內(nèi)多種炎癥細(xì)胞和炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，繼而誘導(dǎo)炎癥的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致患者易出現(xiàn)各器官功能紊亂和衰竭，嚴(yán)重的情況下會(huì)產(chǎn)生休克和死亡等惡性臨床事件。在最新的研究指出，重癥膿毒癥是炎癥反應(yīng)中促炎和抗炎反應(yīng)相互影響的結(jié)果[1]。然而在炎癥反應(yīng)中，Th17細(xì)胞及其相關(guān)炎癥介質(zhì)（IL-6、IL-17）的促炎作用和Treg細(xì)胞及其相關(guān)炎癥介質(zhì)（IL-10、TGF-β）的抗炎作用被認(rèn)為最具有代表性。因此，本文以Th17和Treg細(xì)胞及其炎癥介質(zhì)作為重癥膿毒癥的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行研究，為重癥膿毒癥的臨床研究提供依據(jù)和參考。

1.資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年2月-10月在我院接受治療的重癥膿毒癥患者35例作為研究組，同時(shí)選取健康人群（35例）作為對(duì)照組，兩組患者在病程、年齡、男女性別比例、病歷等資料上均無(wú)顯著差異。其中準(zhǔn)入標(biāo)準(zhǔn)為ACCP（美國(guó)胸科醫(yī)師學(xué)院）和SCCM（美國(guó)危重疾病醫(yī)學(xué)會(huì)）共識(shí)會(huì)議制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)。其中排除標(biāo)準(zhǔn)：患有哮喘、紅斑狼瘡、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等免疫系統(tǒng)疾病的患者；患者出現(xiàn)休克等意識(shí)不全的患者；患有艾滋病、急性冠脈綜合癥、腫瘤、肝炎的患者；患者在住院2個(gè)月內(nèi)使用激素類藥物和免疫抑制類藥物的。

1.2 研究方法

1.2.1 檢測(cè)樣本收集 對(duì)研究組和對(duì)照組的研究對(duì)象全部實(shí)施靜脈抽血（5ml）來獲得其外周血的樣本，其中重癥膿毒癥患者必須在確診1h內(nèi)實(shí)施靜脈抽血,并將獲得的血液樣本滴加肝素做抗凝處理后，置于冰箱（-4℃）下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)Th17與Treg細(xì)胞 在每個(gè)檢測(cè)的樣本中分別取出50ul、100ul分別用于檢測(cè)樣本中Th17與Treg細(xì)胞的含量。在50 ul血液樣本中添加IL-17APE(EB 公司、5ul)，同時(shí)在100 ul血液樣本中添加CD-ECD-CD25-PC5-CD127-PE(EB 公司、10ul)，常溫下避光培養(yǎng)15分鐘，添加紅細(xì)胞裂解液，并繼續(xù)避光培養(yǎng)10分鐘后，添加PBS（1.5ml）后離心5分鐘（1500轉(zhuǎn)/分）去上清（重復(fù)一次）。將獲得的產(chǎn)物置于流式細(xì)胞儀上檢測(cè)Th17和Treg細(xì)胞的含量，其中IL-17A+、CD4+、CD3+、CD3射門均為Th17細(xì)胞，而CD4+CD25+CD127為Treg細(xì)胞。

1.2.3 Th17細(xì)胞相關(guān)IL-6、IL-17和Treg細(xì)胞相關(guān)IL-10、TGF-β的檢測(cè) 對(duì)Th17細(xì)胞相關(guān)IL-6、IL-17和Treg細(xì)胞相關(guān)IL-10、TGF-β的檢測(cè)應(yīng)用ELISA法，具體的實(shí)驗(yàn)操作，參照ELISA試劑盒（上海極威生物科技有限公司）的操作指南進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料采用率（%）表示，進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用（）表示，進(jìn)行t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 重癥膿毒癥患者外周血液中Th17、Treg細(xì)胞的檢測(cè)結(jié)果分析

重癥膿毒癥患者的外周血液樣本中Th17和Treg細(xì)胞的含量顯著升高（較對(duì)照組），P＜0.05，差異顯著有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

表1 重癥膿毒癥患者外周血液中Th17、Treg細(xì)胞的檢測(cè)結(jié)果（）

表1 重癥膿毒癥患者外周血液中Th17、Treg細(xì)胞的檢測(cè)結(jié)果（）

組別 樣本數(shù) Th17（%） Treg（%）研究組 35 5.73±0.31 9.53±0.51對(duì)照組 35 2.35±0.26 5.98±0.26

2.2 重癥膿毒癥患者外周血液中Th17/Treg的比值分析

重癥膿毒癥患者的外周血液樣本中Th17/Treg值顯著升高（較對(duì)照組），P＜0.05，差異顯著有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

表2 重癥膿毒癥患者外周血液中Th17/Treg的比值分析結(jié)果（）

表2 重癥膿毒癥患者外周血液中Th17/Treg的比值分析結(jié)果（）

組別 樣本數(shù) Th17/Treg研究組 35 0.601±0.062對(duì)照組 35 0.393 ±0.029

2.3 重癥膿毒癥患者外周血液中IL-6、IL-17、IL-10、TGF-β的檢測(cè)結(jié)果分析

重癥膿毒癥患者的外周血液樣本中IL-6、IL-17、IL-10、TGF-β的表達(dá)量顯著升高（較對(duì)照組），P＜0.05，差異顯著有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表3。

表3 重癥膿毒癥患者外周血液中IL-6、IL-17、IL-10、TGF-β的檢測(cè)結(jié)果（）

表3 重癥膿毒癥患者外周血液中IL-6、IL-17、IL-10、TGF-β的檢測(cè)結(jié)果（）

TGF-β（Pg/ml）研究組 35 33.62±8.69 113.52±12.61 39.15±9.26 45.36±9.75對(duì)照組 35 11.39±3.95 35.41±7.51 12.33±4.26 18.32±5.11組別 樣本數(shù) IL-6（Pg/ml）IL-17（Pg/ml）IL-10（Pg/ml）

3.討論

在重癥膿毒癥的臨床和發(fā)病機(jī)理研究中，炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致其發(fā)生的核心病理變化過程，其中最具有代表性的促炎細(xì)胞為Th17細(xì)胞，及其相關(guān)的促炎因子IL-6、IL-17，而最具有代表性的抗炎細(xì)胞為Treg細(xì)胞，及其相關(guān)的抗炎因子IL-10、TGF-β。國(guó)內(nèi)外專家指出，Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞的動(dòng)態(tài)平衡過程是決定重癥膿毒癥病變的核心環(huán)節(jié)，當(dāng)Th17細(xì)胞增多且功能增強(qiáng)時(shí)，往往會(huì)誘導(dǎo)體內(nèi)激烈的炎癥反應(yīng)，從而促進(jìn)重癥膿毒癥的發(fā)生；而當(dāng)Treg細(xì)胞增多且功能增強(qiáng)時(shí)，能導(dǎo)致Th17細(xì)胞失活和凋亡，從而抑制炎癥反應(yīng)的進(jìn)程，進(jìn)而標(biāo)志著重癥膿毒癥得到一定的控制。然而國(guó)內(nèi)外報(bào)道中并沒有從患者外周血液的Th17、Treg和其相關(guān)炎癥因子的表達(dá)變化情況中尋找到直接證據(jù)，來充分說明Th17、Treg參與重癥膿毒癥的生物學(xué)機(jī)制。

因此，本文對(duì)Th17和Treg細(xì)胞及其炎癥介質(zhì)作為重癥膿毒癥的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行研究。研究結(jié)果表明，重癥膿毒癥患者的外周血液樣本中Th1和Treg細(xì)胞的含量，IL-6、IL-17、IL-10、TGF-β的表達(dá)量、Th17/Treg值都顯著升高（較對(duì)照組）。而這一結(jié)果也表明了，體內(nèi)的炎癥反應(yīng)是重癥膿毒發(fā)病的重要因素之一；Th17/Treg值的升高表明患者體內(nèi)促炎反應(yīng)（Th17）明顯強(qiáng)于其抗炎反應(yīng)（Treg）。