動物源性食品中克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇快速檢測產品的穩健性評價

喻俊磊,陳 沙，李雨露，李 晴，趙淑娟，蘭 偉

(江西省食品檢驗檢測研究院,江西 南昌 33000)

瘦肉精是一類人工合成的β-受體激動劑，因其可以提高瘦肉率和促進動物生長，而被一些畜牧養殖戶和養殖企業作為養殖促進劑使用。根據其結構差異可分為克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇。人食用了飼喂瘦肉精的禽畜產品后，會引起食物中毒，我國農業農村部公告第235號規定嚴禁在畜牧生產中使用各種β-受體激動劑類藥物[1-5]。目前，市售瘦肉精三聯快速檢測卡大多可同時測定豬肉中的克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇。2015年新版《中華人民共和國食品安全法》[6]規定：“采用國家規定的快速檢測方法對食品進行抽查檢測，被抽查人對檢測結果沒有異議的，可以作為行政處罰的依據”，在某種程度上給快檢結論賦予了法律效力。快檢方法有別于大型儀器方法，是一種包括樣品前處理，短時間內能對相關質量安全指標得出檢測結果的技術[7-8]，食品快檢具有簡便、及時、現場可視化等特點，由此催生食品快檢行業及快速檢測方法的高速發展[9-10]。然而目前對快檢產品的評價屬于備案制時的準入評價，而實際是快檢試劑應該類似于交鑰匙工程，需要考慮運輸、儲存、使用等環節的影響，目前缺乏這方面的評估研究。在基層監管人員使用快檢產品進行食品安全監管時，普遍存在檢出率低的情況，這與監督抽檢等平均不合格率結果相差較大[11]。本文選取β-受體激動劑快檢產品作為研究對象，通過實驗對瘦肉精快檢產品進行穩健性評估，從而建立完整的瘦肉精快檢產品穩健性評估研究體系，用穩健性評估來解決快檢產品不準確的困惑,具有重大意義。同時為食品監管部門購買和使用快檢產品提供科學依據，為快速檢測操作人員提供技術指導。

本研究以瘦肉精膠體金免疫層析試紙條的評價為切入點，系統性地研究膠體金免疫層析類食品快檢產品評價過程中具體的操作問題，主要包括不同溫濕度、貯存時間、模擬振動、樣品基質干擾、不同熟練工操作等。對快檢產品穩健性進行系統性的評價。在國家規范內，做好產品評價過程中的每一個細節，發現存在的問題并探討在實際工作中的解決方法。本研究可為各級監管部門提供實踐依據，為快檢產品評價提供技術借鑒，有利于快檢市場的規范化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇標準品(純度≥98%，由國家糧食局科學研究院提供)；同位素內標：克倫特羅-D9、沙丁胺醇-D3、甲醇(色譜純，由SCHARLAB S.L.公司生產)、乙醇(分析純，由西隴科學股份有限公司生產)、NY針頭式過濾器(WondaDisc Ⅱ，由SHIMADZU-GL公司生產)、磷酸緩沖液(10 mmol/L,pH值7.4，由Sigma公司生產)。

本次評價實驗使用的瘦肉精快速檢測試紙條/卡從市場上購買。

1.2 儀器與設備

超高效液相色譜質譜儀(由美國安捷倫公司生產)、C18色譜柱(ACQUITY UPLC BEH C18，由Waters公司生產)、電熱恒溫鼓風干燥箱(DHG-9420A，由上海一恒科學儀器有限公司生產)、Milli-Q超純水處理系統(由美國Millipore公司生產)、電子天平(QUINTIX213-1CN，由賽多利斯科學儀器有限公司生產)、振蕩器(MMV-1000 W，由上海愛朗儀器有限公司生產)、磁力攪拌器(RCT basic，由IKA公司生產)。

1.3 標準品

克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇參考物質的中文名稱、英文名稱、CAS登錄號、分子式、相對分子量見表1，純度≥97%。

表1 3種標準品參考物質的中文名稱、英文名稱、CAS登錄號、分子式、相對分子質量

1.4 方法

1.4.1 檢測人員篩選和培訓 評價人員由具有一定檢驗基礎與能力的人員組成,并對其進行快檢基本知識、膠體金快速檢測技術基本原理和實驗技能方面進行培訓。為保證評價過程的客觀與公正,人員分成2組,一組人員負責盲樣的制備與定值,一組人員負責快檢產品的測試評價,2組人員互不交叉，另外一組人員則從來沒有接觸過快檢產品。

1.4.2 添加回收實驗 為確保儀器驗證盲樣均勻性實驗的準確性，在開展盲樣制備之前先做豬肉組織中β-受體激動劑添加回收實驗。選取不含瘦肉精的豬肉組織樣品，添加克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇標準品，然后用儀器分析，檢測其含量，并計量回收率。具體步驟如下：(1)選取空白豬肉樣本；(2)制備9個樣品，平均分成3組。每組樣品中添加不同濃度的標準品，3個濃度水平分別為0.1、0.5、1.0 μg/kg；(3)以GB/T 22286—2008[12]的方法——高效液相色譜串聯質譜法，對上述樣品進行檢測，并計量樣品的添加回收率。

1.4.3 盲樣制備 根據《食品快速檢測方法評價技術規范》[10]，制備盲樣的基質應與實際食品樣品所含物質相似，本次評價實驗所用基質是豬瘦肉。該規范同時對測試水平提出了要求，測試水平一般應包括食品基質空白樣品，標準方法檢出水平(或者標準限量值)的0.5、1、2倍水平或者其他可檢測區分的水平(不少于3個)，或者方法標稱檢出限0.5、1、2倍水平或者其他可檢測區分的水平(不少于3個)。本次評價實驗設置4個測試水平，分別為空白樣品、≤0.1 μg/kg(陰性樣品)、0.5 μg/kg(陽性樣品1)、1.0 μg/kg(陽性樣品2)。

從市場上購買瘦肉樣品，經儀器分析確證，克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇都未被檢出，作為空白樣品。向豬肉組織中加入克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇及其同位素內標標準品，磁力攪拌器室溫條件攪拌12 h，制備成上述4種濃度的樣品，再用儀器檢測盲樣的均勻性和穩定性。

1.4.4 盲樣的均勻性和穩定性檢驗 為保證快檢評價實驗的準確性和公正性，根據規范“盲樣必須進行批內均勻性檢查，對于一定時間范圍內檢測的樣品，需要進行穩定性檢查，保證在評價期限內樣品穩定”。將“1.2.2”節制備的各濃度水平的盲樣進行分裝(5 g/管)，先用儀器進行均勻性檢測，每個樣品在重復條件下檢測3次。采用單因素方差分析對數據進行統計分析，使用的軟件為IBM SPSS Statistics 22(International Business Machines Corporation)，通過F-檢驗驗證樣品的均勻性[10]。

將其余樣品置-20 ℃儲存，分別間隔1周、2周、3周取出，每次取出3個樣品，每個樣品重復檢測3次。依據CNAS-GL003[13]規定，將不同儲存時間的檢測平均值與初始檢測平均值進行一致性比較，以考查樣品在評價期內的穩定性。

1.4.5 快檢產品穩健性評價與結果統計 實驗過程中設置不同的運輸溫度、濕度、2個存放時間、模擬振動的有無、樣品前處理溫度設置、不同基質對快檢產品結果的影響以及操作熟練程度的影響，設置運輸時的溫度、濕度、振動等單一因素和多因素交叉復合變量，模擬常規溫度的極限條件下的溫度(0、35 ℃)條件，用快檢產品檢測陽性樣品，同時用儀器分析結果作為標準參照，統計分析溫度因素對最終檢測結果的影響。同上，設置2處典型氣候的濕度(42%、80%)條件，統計分析濕度因素對最終檢測結果的影響。快檢產品經過真實的快遞線路和搖床模擬振蕩，再檢測陽性樣品，同時以儀器分析結果作為標準參照，分析運輸振動因素對檢測結果的影響。統計分析運輸條件因素對最終檢測結果的影響。前處理對樣品進行不同溫度(80、100 ℃)處理，保持溫度和濕度在同一水平考察前處理溫度對快檢產品結果的影響，不同基質和操作熟練程度操作步驟同上。每組實驗設置50個快檢產品，最終以陽性率來評價快檢產品的穩定性程度。

2 結果與分析

2.1 添加回收實驗結果

向陰性瘦肉樣品(不含瘦肉精)中添加克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇標準品，添加濃度水平分別為0.25、0.5、1.0 μg/kg，每個濃度水平取3個重復樣品，按GB/T 22286─2008進行檢測。添加回收實驗結果見表2。此添加回收實驗的回收率范圍為87.7%～112.3%，符合GB/T 27417—2017[14]中“方法回收率偏差范圍”。

表2 豬肉組織中克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇的回收率

注：*表示3次重復。

2.2 樣品的均勻性檢驗

按照CNAS-GL003：2018對樣品的均勻性和穩定性進行驗證。首先對各濃度水平的盲樣均勻性進行檢測。然后，采用單因素方差分析法(F-檢驗)對數據進行統計分析，查看GB/T 15000.5─1994[15]的附錄B“F檢驗法臨界值表”，SPSS軟件分析實驗結果的F值，均勻性檢測結果見表3、表4。3組濃度水平的F值均小于Fcrit，P值均大于0.05，此結果表明在顯著水平α=0.05時，同一濃度水平的所有樣品間無顯著性差異，即制備的樣品是均勻的。

2.3 樣品的穩定性檢驗

盲樣制備完成后置于-20 ℃條件下保存，從中取出用于穩定性檢測的樣品，每次取出3個樣品，按GB/T 22286─2008方法進行檢測，每隔1周檢測1次，每個樣品重復檢測3次，檢測結果見表5。

表3 3種濃度水平樣品的均勻性檢測結果

表4 測試樣品的均勻性分析結果

表5 測試樣品的穩定性檢測結果

將不同儲存時間樣品的平均值與初始檢測平均值進行一致性比較，按照CNAS-GL003：2018中穩定性檢驗的要求，采用t檢驗法“二個平均值之間的一致性”公式計算t值，見表6。查GB/T 15000.5─1994的附錄F“T檢驗法分位數表”，t0.05(37)=2.026，t值都大于2.026，表明各儲存時間的檢測結果與初始檢測結果之間存在顯著性差異。但是從各時間段檢測結果的平均值表現出變異程度較小。快檢產品本身只是對目標化合物做一個初步篩查，對化合物的含量要求不須高度精確。因此，以本研究中的方法制備樣品，在短時間內完成快檢產品的評價，對評價結果的影響會較小。

表6 測試樣品的穩定性分析結果

注：(1)變量1，樣品初始的檢測結果。變量2，不同時間段穩定性實驗檢測結果；(2)T1為1周，T2為2周，T3為3周。

2.4 產品的穩定性評價檢測與結果統計

本研究從儲存溫度(0、35 ℃)、濕度(42%、80%)、月份(7月、12月)、模擬振動條件(有、無)、樣品前處理加熱溫度(80、100 ℃)、基質干擾(豬肉組織和尿液)、操作熟練程度(新人、熟練工)等7個方面對快檢產品的穩健性進行評價，在設置溫度變量時，其他條件保持在同一水平，即濕度在42%，月份為7月，不設振動條件，樣品前處理加熱溫度為80 ℃的豬肉組織，并采用熟練工進行操作，結果見表7。每一組變量分別進行50次平行試驗得出陽性率，即檢出率。

表7 不同存儲條件對快檢產品的穩健性評價

注：*樣品嚴格按快檢產品說明書進行前處理、檢測和判讀，平行重復測試50次，得出陽性率。

2.5 結果統計與討論

通過制備的樣品對快檢產品進行測試，按照“快速檢測方法性能指標計算表”對檢測結果進行了統計分析，結果表明：瘦肉精快檢產品在溫度分別為0 ℃和35 ℃貯存時，檢出率為94%和96%，濕度為42%和80%時的檢出率為96%、82%，模擬月份在7月和12月的檢出率為96%和85%，快檢產品在模擬振動和不振動條件下的檢出率為93%和96%，樣品前處理加熱溫度分別為80 ℃和100 ℃時的檢出率為96%和98%，不同基質樣品包括豬肉組織和豬尿液的檢出率為96%和88%，不同操作熟練程度的檢出率為96%和80%。由上述結果可看出，快檢產品在不同的貯存溫度和濕度環境下運輸對檢測結果的影響在15%以上。模擬不同的時間段主要是7月和12月時，檢出率95%。使用月份對快檢產品的穩定性影響不大。運輸過程中的振動有無對快檢產品的檢測結果影響不大，檢出率可達93%。前處理加熱溫度對快檢產品影響較大，樣品在前處理過程中加熱80 ℃時的陽性率為88%，而100 ℃時的檢出率可達95 ℃，可見充分加熱處理樣品可以將瘦肉精有效的釋放，有利于富集濃縮處理液，檢出率也更高。同時不同的基質對快檢試劑的影響也較大，采用豬肉組織陽性樣品進行檢測時檢出率為81%，而基質為尿液時的陽性率為96%。對不同熟練程度的快檢人員使用產品的陽性率也有差異，熟練操作快檢產品的人員陽性率可達到96%，而新成員則為80%左右。由此得出豬肉組織溫度35 ℃、濕度42%，前處理溫度為100 ℃并采用熟練工操作時，樣品的檢出率高達95%以上，表明快檢產品在此條件下的穩定性更高。

3 結論

本研究采用豬肉基質加標的方法制備3種不同濃度水平的瘦肉精樣品，對市售膠體金免疫層析試紙條/卡進行評價測試。根據評價結果可知，制備的盲樣均勻性良好，由此可以看出快檢產品在貯存和運輸過程對產品的檢測結果具有一定影響，樣品的前處理加熱條件是影響快檢產品穩定性的最大因素，其次是溫度和濕度。因此影響快檢產品穩健性的因素，由大到小依次為：樣品的前處理條件>樣品前處理的熟練程度>樣品的基質>溫度>濕度>快檢產品的貯存和運輸過程。本文建議在快檢產品的使用過程中應該充分考慮快檢產品儲存運輸條件，和使用過程中控制好產品的溫濕度同時，采用熟練人員操作產品可以大大提高產品的準確率。