微生物發(fā)酵中溶氧濃度的控制研究

李昶志，潘忠成，翁 婧，李蒲民

(1.陜西省公共資源交易中心，陜西 西安 710061；2.陜西麥可羅生物科技有限公司，陜西 西安 712004)

1 引言

我國在微生物研究方面取得重要進(jìn)展。微生物在發(fā)酵過程中起著重要的作用，而發(fā)酵液的含量決定著微生物生長的進(jìn)度和好壞，因此溶氧濃度直接影響到微生物的代謝成果。適宜的發(fā)酵環(huán)境，合理的控制微生物的作用是微生物發(fā)酵的重要手段。溶氧濃度一般指氧氣溶解于液體的密度。標(biāo)準(zhǔn)情況下是在25 ℃的大氣壓力下進(jìn)行測試，一般濃度為0.25 mmol/L。而微生物在進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，會(huì)消耗氧氣的溶解度，氧氣的濃度與所處的溫度和壓力有關(guān)，其中一種增大就會(huì)上升，簡稱DO。而DO是微生物發(fā)酵中一種重要的數(shù)據(jù)參數(shù)，主要決定著發(fā)酵過程中的穩(wěn)定和代謝成果，參數(shù)DO的好與壞直接影響到微生物發(fā)酵的和生產(chǎn)成本，因此企業(yè)高度重視這項(xiàng)參數(shù)的研究。

2 溶氧濃度對(duì)微生物發(fā)酵的主要影響

2.1 對(duì)微生物的生長影響

首先在微生物的生長中，高濃度的溶氧濃度會(huì)對(duì)微生物發(fā)酵產(chǎn)生負(fù)面影響，據(jù)專家研究分析超高的溶氧濃度不僅會(huì)大量消耗能量，發(fā)酵過程中還會(huì)產(chǎn)生泡沫，影響正常發(fā)酵，而且在這一過程中會(huì)出現(xiàn)新生氧、超氧化物基或者羥基自由基等分子，以致破壞了原有的微生物細(xì)胞結(jié)構(gòu)。專家還曾對(duì)球形芽孢桿菌進(jìn)行了研究，通過研究表明，芽孢的生長和溶氧濃度有重要的關(guān)系，研究表明溶氧濃度越高，芽孢生長越快越多，但高到一定程度時(shí)，芽孢的形成反而下降。因此總結(jié)來看芽孢在生長過程中初期需要充足的氧氣供應(yīng)，有助于芽孢的大量生產(chǎn)，而到了芽孢生長的成熟期時(shí)，過高的氧氣會(huì)使芽孢出現(xiàn)自溶現(xiàn)象，大大降低了芽孢的生長效率。專家華瞡薇曾在黃原膠發(fā)酵條件的研究中,發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液中的溶氧濃度對(duì)菌體生長速率影響不大,但是對(duì)菌體濃度達(dá)到最大之后的菌體的穩(wěn)定期的長短卻有著明顯的影響。

溶氧濃度還會(huì)影響到微生物酶的活性以及代謝途徑，長期下去對(duì)微生物的生長和代謝都產(chǎn)生破壞，使代謝產(chǎn)物降低。在目前的生物科學(xué)技術(shù)水平下，研究表示溶氧濃度不同時(shí)，所發(fā)酵出來的谷氨酸所需的兩種不同的酶以及代謝情況都會(huì)產(chǎn)生影響。據(jù)數(shù)據(jù)顯示，溶氧濃度在低濃度下，三羧酸的效果會(huì)降低，不能和葡萄糖酵解的效果相適應(yīng)，不能穩(wěn)定平衡條件，另外，還致使LDH的生命力，讓代謝產(chǎn)物出現(xiàn)大量的乳酸；在溶氧濃度較高的情況下，GDH的活性便下降了許多，從而促進(jìn)三羧酸的活力，產(chǎn)生大量的CO2，導(dǎo)致碳源損失，因此，以上兩種情況都會(huì)影響到谷氨酸的正常生成。

2.2 對(duì)微生物的代謝影響

微生物在發(fā)酵的不同階段對(duì)氧氣的需求程度也不同，例如在生產(chǎn)透明質(zhì)酸時(shí)，溶氧濃度在透明質(zhì)酸的影響下會(huì)出現(xiàn)兩個(gè)相反的平衡作用。一個(gè)是當(dāng)溶氧上升時(shí)可以促進(jìn)透明質(zhì)酸的生成。因?yàn)橥该髻|(zhì)酸是菌體莢膜的主要成分，主要保護(hù)A族和C族鏈球菌防止受到外界氧自由基的襲擊。而另一個(gè)是當(dāng)溶氧濃度不斷提高時(shí)，加快了氧自由基的生長，大大增強(qiáng)了破壞A族鏈球菌的能力。以50%溶氧值作為一個(gè)交接點(diǎn)，過高會(huì)降低HA分子量，過度會(huì)影響到菌群的正常生長，因此，溶氧濃度是微生物發(fā)酵中的一重要因素,好氧發(fā)酵中通常需要供給大量的空氣才能滿足微生物對(duì)溶氧的需求。

3 溶氧濃度的電極工作原理

在進(jìn)行溶氧濃度電極工作時(shí)，通常是極譜型電極用作溶氧電極,陽極為Ag/Ag Cl、陰極為鉑金(Pt),兩者之間充滿電解液,然后利用硅橡膠滲透膜包綁于電極四周。應(yīng)用這種方法時(shí)還要適當(dāng)?shù)倪M(jìn)行恒定極化電壓，當(dāng)氧氣穿過滲透性膜再由發(fā)酵液進(jìn)入到電解液時(shí)，氧氣就會(huì)被陰極還原，從而檢測出電流。而測出的電流大小與氧氣通過陰極的速率相關(guān)系。因此，測出的電流就是氧氣到陰極的速率，甚至又與氧氣到外面的速率、跨膜的速率等有關(guān)。如果把溶氧濃度電極上產(chǎn)生的各種現(xiàn)象都全部拋去，則氧氣通過陰極的速率和氧氣進(jìn)行跨膜運(yùn)輸?shù)乃俾食烧龋鯕庠诎l(fā)酵液中傳播的速率和氧氣的總濃度也呈一定的比例關(guān)系。反之，當(dāng)氧氣濃度調(diào)整到零時(shí)，跨膜速率則與發(fā)酵液中的溶氧濃度成正比。

4 影響溶氧濃度的主要因素

4.1 發(fā)酵罐通氣量的影響

通過發(fā)酵罐通氧氣可能會(huì)影響到溶氧濃度進(jìn)入微生物中的量度。微生物在發(fā)酵時(shí)也在不斷的生長，不斷增加的菌體所需的氧氣也就加大，如果停止了氧氣的傳輸，瓶中的氧氣就會(huì)被微生物消耗完。因此，在企業(yè)生產(chǎn)中一般會(huì)安裝閥門進(jìn)行很好的調(diào)節(jié)運(yùn)輸工作。

4.2 攪拌速率的影響

在電極中，會(huì)消耗大量的氧氣，由于電極信號(hào)和氧滲透膜傳遞存在正相關(guān)，傳遞的速率又與跨膜速率有關(guān)，因此加快跨膜速率就等于增加氧的溶解濃度，但跨膜速率也有一定的極限，當(dāng)電極發(fā)出信號(hào)為最好時(shí)間，產(chǎn)生的數(shù)據(jù)也比較準(zhǔn)確。而且，再加上攪拌的過程中會(huì)使產(chǎn)生的泡沫分散，隨著液體流動(dòng)并逐漸消失，從而使得液體和氧氣更好的融合，把空氣合理的攪拌下快速轉(zhuǎn)化成小氣泡，增加液體和氣體的傳遞速度以及面積從而提高溶氧濃度，最為關(guān)鍵的是溶氧電極工作之前進(jìn)行有序的攪拌工作。

4.3 適宜的溫度影響

微生物在發(fā)酵時(shí)要合理把控溫度，哪怕只是0.5 ℃之間的波動(dòng)，也會(huì)對(duì)電極產(chǎn)生很大的影響。據(jù)可靠數(shù)據(jù)顯示，微生物發(fā)酵溫度一般在30 ℃左右，其中也會(huì)存在將近3%℃的電極測量誤差。而且溶氧濃度的變化周期一般為2～3 min一次，明顯顯示出溫度對(duì)它的影響之大。過高或過低的溫度將產(chǎn)生大幅度的漂移。企業(yè)在進(jìn)行微生物發(fā)酵時(shí)要嚴(yán)格把握好溫度的適宜范圍，減少溫度帶來的影響程度。另外，在操作發(fā)酵罐時(shí)，準(zhǔn)確標(biāo)好電極溫度，防止有的電極自身存在溫度，以致后續(xù)數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確，有條件可安裝溫度傳感器，進(jìn)行時(shí)刻測量溫度。

5 溶氧濃度的主要調(diào)節(jié)措施

調(diào)節(jié)溶氧濃度主要就是為了使發(fā)酵液維持在適宜的環(huán)境下，以便微生物正常生長從而起到發(fā)酵作用，獲得高質(zhì)量高產(chǎn)量代謝物。一般調(diào)控需要參考溶氧濃度的測量值、氧氣含量檢測值，微生物發(fā)酵速度值以及當(dāng)前大氣壓、溫度等具體數(shù)據(jù)信息。而真正微生物發(fā)酵溶氧濃度測量時(shí)，結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，既受到外部環(huán)境的影響還有內(nèi)部的微生物等因素。可以從以下3個(gè)方面進(jìn)行調(diào)控。

5.1 配制合理的氧氣溶解度

一般控制溶氧濃度的直接方法是合理控制氧氣通氣量，通過氣壓傳遞到溶液里面。在微生物發(fā)酵初期，因?yàn)榫w密度大，需要大量氧氣進(jìn)行發(fā)酵，可以減少瓶裝溶液量或者加快攪拌和轉(zhuǎn)速，速度越快氧氣通入的也越多。不同的菌體發(fā)酵也有不同的方法，比如高密度培養(yǎng)需要通入純氧，而厭氧型發(fā)酵所需氧含量不高，則要降低。生活中的啤酒發(fā)酵就屬于厭氧型發(fā)酵。而且，由于氧氣是難溶性氣體，需要控制合理的壓力和溫度才能使溶氧濃度最大，在近幾年的微生物研究中表明溶氧對(duì)L-天冬酞胺酶發(fā)酵的影響及其控制中,采用在發(fā)酵液中添加氧載體(5%正十二烷)的方式來增加DO,提高L-天冬酞胺酶的發(fā)酵水平(21%左右)。

5.2 調(diào)節(jié)氧氣的跨膜傳遞速率

氧氣在進(jìn)行跨膜傳遞時(shí)對(duì)電動(dòng)機(jī)的攪拌速度、空氣流速、消泡劑、發(fā)酵液成分及理化性質(zhì)、發(fā)酵液溫度等有重要的關(guān)系，當(dāng)適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)控制好攪拌速度、控制流速、以及適宜的溫度時(shí)，可以加快氧氣跨膜傳遞的速率，從而促進(jìn)微生物發(fā)酵的效率。另外，消泡劑有一定的輔助功能，可以適當(dāng)?shù)慕档桶l(fā)酵中產(chǎn)生的泡沫，而這些泡沫會(huì)阻礙氧氣的正常運(yùn)輸。

5.3 合理控制微生物攝入的氧氣量

微生物在進(jìn)行攝氧時(shí)，與微生物的種類、微生物的生長狀態(tài)、接種量感染雜菌等因素有關(guān)，比如需氧型微生物發(fā)酵時(shí)如果接種量、耗氧量、以及攝氧率都非常的高，將嚴(yán)重影響到溶氧濃度的反映。在特殊情況下溶氧濃度反映越劇烈，發(fā)酵液的pH值波動(dòng)越大，則表示發(fā)酵液已經(jīng)被雜菌感染。

6 結(jié)語

在微生物的發(fā)酵過程中，溶氧濃度對(duì)微生物的生長和代謝產(chǎn)物有著重要的作用。因此，微生物發(fā)酵的成功或失敗溶氧濃度起著主導(dǎo)地位，企業(yè)要合理控制溶氧濃度總結(jié)起來需要對(duì)氧氣的溶解度、氧氣的跨膜運(yùn)輸效率以及微生物的攝氧量進(jìn)行研究。微生物發(fā)酵是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過程，因此溶氧濃度的調(diào)控也是動(dòng)態(tài)的，依據(jù)當(dāng)前發(fā)酵的實(shí)際情況，進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)和方法，使溶氧濃度達(dá)到合適的作用水平。

最近幾年，我國科技水平和人工智能快速發(fā)展，而微生物的研究在其中慢慢發(fā)展起來，從最開始的測量溶氧濃度，分析反饋問題，再發(fā)展到溶氧濃度的自動(dòng)化控制為一體，這一系列的成果不斷提高。比如相關(guān)專家就對(duì)這類溶氧濃度進(jìn)行研究分析，結(jié)果表明溶氧濃度可以和葡萄糖產(chǎn)生脈沖進(jìn)而發(fā)生反應(yīng)，出現(xiàn)震蕩的現(xiàn)象就表明大腸桿菌正在生長，從而檢驗(yàn)處是否有乙酸產(chǎn)生，據(jù)數(shù)據(jù)表示這是當(dāng)前較高的生物技術(shù)水平。另外，在溶氧電極方面，添加脈沖信號(hào)可以準(zhǔn)確地檢驗(yàn)出乙酸的存在，應(yīng)通過底物的反饋速率，降低了出現(xiàn)乙酸的概率，甚至提高了底物消耗的速度。