KLF15基因在乳腺癌組織中表達變化及對乳腺癌細胞MCF-7增殖能力的影響

高溫杰，王振國，劉顯勝，任貴兵

(1武警后勤學院，天津300300；2武警特色醫學中心)

乳腺癌發病率居女性惡性腫瘤首位[1]。乳腺癌增殖的相關分子機制是相關研究熱點之一。Kruppel樣因子(KLF)是一個轉錄因子家族，其羧基末端區域包含三個不同的C2H2型鋅指結構域，在DNA結合和核定位中發揮關鍵作用[2,3]。KLF15是KLF家族的一員，從人腎臟cDNA文庫中獲得[4]。KLF15在人體多個組織中表達，包括腎臟、肝臟、心臟、脂肪和骨骼肌等[5]。KLF15的N端富含絲氨酸和脯氨酸，可起到轉錄激活功能[6]。目前研究表明，一些KLF家族成員在人類惡性腫瘤如乳腺癌、結腸癌、胃癌、胰腺癌和肝癌中起著關鍵作用[7]。體外研究表明，KLF15可能對胰腺癌細胞、子宮內膜癌細胞產生抗增殖作用[8]；KLF15過表達后可抑制人宮頸癌細胞HeLa和人肝癌細胞Smmc7721的細胞活力和增殖能力，阻滯細胞周期于G0/G1期，且細胞周期調控因子p21的表達與KLF15的表達呈正相關[9]。2018年10月～2019年6月，本研究觀察了KLF15在乳腺癌組織中的表達變化及對乳腺癌細胞MCF-7增殖能力的影響，并探討相關機制。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞與材料 人乳腺癌細胞MCF-7由天津市腫瘤醫院贈送。pcDNA3.1-KLF15質粒和pcDNA-3.1空載質粒均購自上海生工生物工程公司。胎牛血清和RPMI-1640培養基購于Gibco公司。Lipofectamine3000購于北京賽默飛公司。Giemsa染色液購于北京索萊寶公司。PCR引物購自上海生工生物工程公司。逆轉錄試劑盒及實時熒光定量PCR試劑盒購自江蘇康為世紀生物科技有限公司。羊抗人KLF15抗體購自Abcam公司。兔抗人p21和兔抗人p27抗體及羊抗兔二抗購自沈陽萬類生物科技有限公司。MTT購自Promega公司。細胞周期、細胞凋亡檢測試劑盒購自杭州碧云天公司。

1.2 乳腺癌組織中KLF15 mRNA表達分析 分別利用生物信息學工具Cancer RNA-seq Nexus(CRN，http://syslab4.nchu.edu.tw/)和UALCAN(http://ualcan.path.uab.edu/index.html)分析TCGA數據庫中乳腺癌樣本的RNA序列數據(1 065例乳腺癌組織、114例正常乳腺組織)，對比分析乳腺癌組織與正常乳腺組織中KLF15 mRNA的表達水平。

1.3 細胞分組及KLF15過表達質粒轉染 用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基培養MCF-7細胞株，在5% CO2、37 ℃孵箱中培養2 d至對數期，接種至6孔板，每孔4.5×105個細胞。細胞再次貼壁至75%左右時，將細胞分為過表達組、空載組、空白組。過表達組轉染pcDNA3.1-KLF15過表達質粒，空載組轉染pcDNA3.1空載質粒，空白組不轉染質粒。操作方法：將P3000TMReagent 5 μL與待轉質粒2.5 μg及無血清不含雙抗培養基125 μL混勻(A液)，Lipofectamine3000 3.75 μL與無血清不含雙抗培養基125 μL混勻(B液)，A液與B液混勻后在超凈臺中孵育15 min。再次混勻脂質體復合物后取250 μL加入細胞培養板，37 ℃培養8 h后，更換完全培養基后繼續培養36 h。采用Western blotting法檢測各組細胞中的KLF15蛋白，過表達組、空載組、空白組KLF15蛋白相對表達量分別為2.37±0.36、1.30±0.32、1.29±0.24，過表達組KLF15蛋白相對表達量高于空載組和空白組(P均<0.05)，表明pcDNA3.1-KLF15過表達質粒轉染成功。

1.4 細胞增殖能力觀察 采用MTT比色法。取過表達組和空載組細胞，制成單個細胞懸液后細胞計數，將細胞接種于96孔板，1×104/孔。分別培養6、12、24、48 h后加入MTT試劑20 μL/孔，繼續培養4 h后棄掉培養基并加入DMSO 200 μL，低速振蕩10 min，酶標儀檢測490 nm波長的吸光度值代表細胞增殖能力，重復3次。

1.5 克隆形成率測算 取過表達組和空載組細胞，接種于6孔板，2×102/孔，培養箱中培養至肉眼可見細胞集落后，PBS洗滌3次，4%多聚甲醛固定0.5 h后，加入配制好的Giemsa染色液500 μL染色30 min，流水洗去染色液。顯微鏡下計數細胞克隆數(大于50個細胞計為1個克隆)，計算克隆形成率。克隆形成率=(克隆數/接種細胞數)×100%。

1.6 細胞周期檢測 胰酶分別消化過表達組和空載組細胞，收集至離心管后離心，用4 ℃預冷的PBS洗滌1次后加入4 ℃預冷的70%乙醇1 mL固定，4 ℃過夜，再次離心后用4 ℃預冷的PBS洗1遍。配制PI染色液，取0.5 mL染色液加入細胞，緩慢重懸，37 ℃水浴鍋中避光溫水浴45 min后上機檢測。

1.7 p21、p27基因及蛋白檢測 采用qRT-PCR法檢測p21、p27基因。p21基因上游引物序列為5′-AAGACCATGTGGACCTGTCA-3′、下游引物序列為5′-CGTTTGGAGTGGTAGAAATCTG-3′，p27基因上游引物序列為5′-AAGGAAGCGACCTGCAAC-3′、下游引物序列為5′-CTCCACAGAACCGGCAT-3′，內參β-actin上游引物序列為5′-CTGGGACGACATGGAGAAAA-3′、下游引物序列為5′-AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC-3′。提取過表達組和空載組細胞總RNA，逆轉錄獲得cDNA進行PCR反應。反應條件為95 ℃預變性10 min后繼續變性10 s，61 ℃退火30 s，62 ℃延伸32 s，循環40次。以2-ΔΔCt表示目的基因相對表達量。采用Western blotting法檢測p21、p27蛋白。RIPA裂解過表達組和空載組細胞后提取總蛋白，G250法測定濃度并定量。以80 V恒壓電泳60 min后再以120 V恒壓電泳至結束。于4 ℃層析冷柜中90 V恒壓下轉膜60 min，PVDF膜于3%脫脂奶粉中封閉3 h。TBST漂洗3次，10 min/次。4 ℃條件下加一抗(β-actin 1∶1 000、KLF15 1∶1 000、p21 1∶1 000、p27 1∶500)孵育過夜。TBST漂洗3次，10 min/次。室溫下加二抗(羊抗兔1∶10 000)孵育2.5 h，TBST漂洗后顯影。用Image Lab軟件分析條帶灰度值，以目的蛋白與內參β-actin蛋白灰度值的比值表示目的蛋白相對表達量。

2 結果

2.1 乳腺癌組織中KLF15 mRNA表達變化 CRN分析結果顯示，不同分期乳腺癌組織中KLF15 mRNA表達均低于正常乳腺組織(P均<0.05)。UALCAN分析結果顯示，乳腺癌組織中KLF15 mRNA表達下調(P<0.05)。見圖1。

注：A為UALCAN分析結果；B為CRN分析結果。

2.2 過表達組與空載組培養不同時間細胞增殖能力比較 過表達組培養24、48 h細胞增殖能力均低于空載組(P均<0.05)。見表1。

表1 過表達組與空載組培養不同時間細胞增殖能力比較

注：與同時點空載組相比，*P<0.05。

2.3 過表達組與空載組克隆形成能力比較 過表達組和空載組克隆數分別為(40.89±1.56)、(79.11±5.31)個，克隆形成率分別為20.5%±0.7%、39.6%±2.6%，過表達組克隆形成率低于空載組(P<0.05)。見圖2。

2.4 過表達組與空載組細胞周期比較 過表達組G0/G1期細胞比例高于空載組(P<0.05)。見表2。

2.5 過表達組與空載組細胞中p21、p27基因及蛋白表達比較 過表達組p21基因及蛋白表達高于空載組(P均<0.05)。見表3。

圖2 過表達組與空載組克隆形成情況

組別細胞周期G0/G1S期G2/M期過表達組42.47±0.64?40.24±0.6916.49±0.48空載組51.59±0.7537.70±0.9014.60±1.19

注：與空載組相比，*P<0.05。

表3 過表達組與空載組細胞中p21、p27基因及蛋白表達比較

注：與空載組相比，*P<0.05。

3 討論

KLF家族不僅參與多種細胞的正常生理過程，同時也與惡性腫瘤的發生和發展密切相關[10]。有學者發現孕酮受體能夠誘導KLF15的表達，同時也發現KLF15結合于E2F1的啟動子區，提示KLF15是作為轉錄因子來發揮作用的[11]。KLF15是KLF家族的一員，研究證實其在多種惡性腫瘤細胞系中發揮抗增殖活性。KLF15在胃癌組織中表達明顯下調，KLF15過表達后通過調節p21和p57的表達從而抑制胃癌細胞增殖[12]。在食管鱗狀細胞癌中，KLF15可激活脂質運載蛋白2(LCN2)的轉錄和翻譯，而LCN2在癌組織中高表達，且與腫瘤大小、分期和侵襲性等密切相關[13]。肺癌組織中KLF15呈低表達，與患者預后密切相關[14]。

梁鈴等[15]應用生物信息學方法分析了KLF15在乳腺癌中的表達變化，發現KLF15與乳腺癌預后顯著相關，但KLF15在乳腺癌組織和正常組織中表達差異無統計學意義。本研究結果顯示，乳腺癌組織中KLF15 mRNA呈低表達，且不同分期的乳腺癌患者腫瘤組織中KLF15 mRNA表達均低于正常乳腺組織。進一步體外實驗發現，KLF15基因表達上調的乳腺癌細胞增殖能力、克隆能力受到抑制，提示KLF15可能在乳腺癌中起抑瘤作用。

為研究KLF15的抑瘤作用機制，我們應用流式細胞儀分析了過表達組和空載組的細胞周期，結果顯示，過表達組G0/G1期細胞比例高于空載組，表明KLF15可使乳腺癌細胞周期阻滯于G0/G1期。Ray等[8]研究也發現了KLF15在細胞周期調節中的作用，他們的研究表明，KLF15可能通過抑制DNA復制從而阻滯人子宮內膜癌細胞系的細胞周期。此外，在正常腎小球系膜細胞中，KLF15也可通過調節細胞周期相關基因的表達來抑制細胞增殖[16]。本研究結果與上述研究一致。

p21是一種眾所周知的細胞周期調節因子[17]。在細胞周期調控系統中，p21為負性調控因子，具有抑癌作用。p27也屬于CKI家族，為具有抑癌作用的細胞周期負調控因子，是一個重要的抑癌基因。我們研究了KLF15表達與p21、p27表達的關聯性，結果顯示，過表達組p21基因及蛋白表達高于空載組，兩組p27基因及蛋白表達差異無統計學意義。這提示在乳腺癌細胞系MCF-7中，KLF15誘導的細胞周期阻滯可能由p21介導，與p27關系不明顯。

總之，本研究發現，KLF15 mRNA在乳腺癌組織中表達明顯下調。KLF15基因表達上調的乳腺癌細胞增殖能力、克隆形成能力減弱，細胞周期阻滯于G0/G1期。KLF15對乳腺癌細胞的增殖抑制機制可能與上調p21表達有關。上述研究結果為KLF15作為乳腺癌新的治療靶點提供了理論依據。