類風濕關節炎患者外周血單個核細胞中miR-21表達變化及其意義

董小敏，張瑞，郭粉玲，馬亞萍

(咸陽市中心醫院，陜西咸陽712000)

類風濕關節炎(RA)是一種常見炎癥性自身免疫疾病，臨床主要表現為關節功能障礙，致殘率較高，嚴重影響患者生活質量[1]。RA發病原因較為復雜，主要是機體獲得性免疫應答失調，引起免疫功能異常[2]。目前治療RA的目標是緩解臨床癥狀、降低疾病活動度，其中超敏C反應蛋白(hs-CRP)、類風濕因子(RF)、抗環瓜氨酸肽抗體(CCP)、紅細胞沉降率(ESR)等是臨床診斷及評價RA活動度的常用指標。miRNA在調控細胞增殖、分化、凋亡等方面具有重要作用[3]。研究表明，miR-146a在RA患者中表達異常，促進RA活動期的發展[4]。還有研究發現，miR-21在RA患者中的表達與Th17/Treg失衡有關，但針對miR-21與RA疾病活動度關系的研究較少。因此，本研究觀察了RA患者外周血單個核細胞(PBMC)中miR-21的表達變化，并分析其與疾病活動度的關系，以期為RA的治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2015年12月～2018年12月在我院接受治療的RA患者102例納入研究[5，6]。其中男45例，女57例；年齡18～75歲，中位年齡55.07歲；RA活動期60例(活動期組，活動期初發的RA患者DAS評分>3.2)、緩解期42例(緩解期組)。排除合并其他自身免疫系統疾病者，合并肝、腎、心臟功能障礙等嚴重疾病者，合并腫瘤、感染性疾病者，不配合醫生治療者。選擇同期在本院健康體檢的志愿者50例作為對照組，男21例、女29例，年齡20～76歲、中位年齡54.59歲。各組受試者性別、年齡具有可比性。本研究經醫院倫理委員會批準,受試者均自愿簽署知情同意書。

1.2 標本獲取與處理 采集所有受試對象入院24 h內清晨空腹靜脈血6 mL分為2個管，一管室溫靜置1 h，4 000 r/min離心10 min，吸取上層血清分裝于無菌EP管中，置于-20 ℃冰箱中保存待測；一管分離外周血PBMC。

1.3 外周血PBMC中miR-21檢測 采集血液經肝素抗凝，加入等體積PBS混勻;Ficoll淋巴細胞分離液離心分層，吸取外周血PBMC于離心管中;PBS洗滌3次，收集貼壁細胞置于含10%～20%胎牛血清培養液中培養。提取總RNA，檢測其濃度和純度。將RNA反轉錄為cDNA并進行qRT-PCR反應。以U6為內參。miR-21上游引物序列為5′-AGCTGGGTAGCTTATCAGACTGAT-3′，下游引物序列為5′-ACTGGTGTCGTGGAGTCG-3′；U6上游引物序列為5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，下游引物序列為5′-GCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。反應條件為94 ℃預變性60 s,94 ℃ 45 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s，共40個循環。采用2-ΔΔCt表示miR-21的相對表達量。

1.4 疾病活動度相關指標檢測 采用免疫比濁法檢測血清hs-CRP、RF。采用ELISA法測定血清抗CCP。采用血細胞自動分析儀以魏氏法檢測ESR。按照相應試劑盒說明書進行操作，每個樣品均設置3個重復，取平均值。進行疾病病情評分(DAS28)，DAS28分值范圍為0～10分，分值越高表明疾病活動度越高。

1.5 指關節炎癥相關指標檢測 采用彩色多普勒超聲檢查，以血成像和能量圖觀察血供情況。患者仰臥位，雙手分開置于檢測臺上，檢測雙手掌指關節、近端指間關節，每個側面均進行縱切面和橫切面掃查，在垂直骨面最厚的地方測量滑膜組織厚度。滑膜厚度<2 mm為正常，2～5 mm為輕度增生，5～9 mm為中度增生，>9 mm為重度增生。滑膜組織無血流信號為0級，1～2個點狀血流信號為1級，有1～3條小血管為2級，4條以上且呈網狀分布的血管為3級。同時隨機選取滑膜內的動脈采用彩色血流進行脈沖多普勒取樣，當滑膜內動脈的血流頻譜顯示清楚后測量血流的收縮期峰值流速(Vmax)，舒張末期流速(Vmin)，記錄并自動計算滑膜動脈RI值。RI=(Vmax-Vmin)/Vmax，可多次取樣，均測量2次取平均值。

2 結果

2.1 三組外周血PBMC中miR-21表達比較 活動期組、緩解期組、對照組外周血PBMC中miR-21相對表達量分別為0.26±0.03、0.52±0.06、1.31±0.22，活動期組低于緩解期組，緩解期組低于對照組，兩兩相比，P均<0.05。

2.2 三組疾病活動度相關指標及指關節炎癥相關指標比較 活動期組血清hs-CRP、RF、抗CCP、ESR、DAS28評分、滑膜厚度、滑膜血流分級、滑膜動脈RI高于緩解期組(P均<0.05)，且緩解期組各指標均高于對照組(P均<0.05)。見表1。

表1 三組疾病活動度相關指標及指關節炎癥相關指標比較

注：與對照組相比，*P<0.05；與緩解期組相比，△P<0.05。

2.3 miR-21表達與RA活動期患者疾病活動度指標、指關節炎癥指標的相關性 RA活動期患者外周血PBMC中miR-21與血清hs-CRP、RF、ESR水平及DAS28評分、滑膜厚度呈負相關(r分別為-0.621、-0.639、-0.657、-0.515、-0.559，P均<0.05)，與抗CCP水平、滑膜血流分級、滑膜動脈RI無顯著相關性(r分別為-0.251、0.137、0.125，P均>0.05)。

2.4 miR-21對RA活動期的診斷價值 miR-21截斷值為0.93，診斷RA活動期的ROC曲線下面積(AUC)為0.907，敏感度為91.94%，特異度為88.10%，約登指數為0.800。

3 討論

RA病變關節腔聚集大量淋巴細胞和巨噬細胞，引起關節滑膜、周圍結締組織異常增生，大量新生血管和炎細胞浸潤[6]。RA以慢性、侵蝕性關節滑膜炎為特征，進而侵犯關節軟骨，韌帶、肌腱、軟骨下骨等，導致骨、關節軟骨、關節囊破壞，造成關節畸形及功能喪失，嚴重影響患者生活質量[7]。RA發病機制復雜，多種細胞因子參與RA的發生發展[8]。

miRNA是機體免疫反應的重要調節因子，可調控多種細胞因子表達，參與多種炎癥性疾病[9]。近年來研究表明miRNA調控人類約1/3的基因，在維持免疫功能、調控免疫系統等方面發揮重要作用[10]。異常表達的miRNA可能與腫瘤、慢性炎癥、自身免疫性疾病的發病相關。miR-21的編碼基因位于液泡膜蛋白基因的編碼區，具有抑制多種細胞凋亡的作用[11]。在結直腸癌中，miR-21通過抑制PDCD4的表達，增強腫瘤細胞浸潤，抑制細胞凋亡[12]。在哮喘中，miR-21調控炎癥因子的表達，在氣道重塑中發揮重要作用[13]。Dong等[14]報道，RA患者miR-21表達異常降低與Th17/Treg失衡相關。本研究結果顯示，RA活動期患者外周血PBMC中miR-21表達降低，且低于緩解期患者，提示miR-21與RA發病及疾病活動度存在密切聯系。

hs-CRP在機體發生炎癥或組織損傷時水平顯著升高，可反映炎癥嚴重程度[15]。RF為RA敏感性標志物，但特異性稍差[16]。抗CCP特異性高于RF，因此抗CCP與RF聯合診斷RA有助于降低誤診率。研究報道，抗CCP陽性患者發生侵蝕性關節炎的風險高于陰性患者，其不僅可作為RA早期臨床診斷指標，還可作為RA患者骨關節破壞的預測指標[17]。ESR是評價RA活動期的重要指標之一。炎癥活動期時炎癥因子水平增加，紅細胞易發生聚集，ESR水平因此升高[18]。RA活動期超聲檢查表現為低回聲，這與患病關節滑膜異常增生有關[19]。滑膜增生引起血流灌注增多及血管過度增生，而滑膜內血流信號異常是RA的特征性變化[20]。RI是反映舒張期血流的指標，可作為評估RA病情的重要指標。

本研究結果顯示，RA活動期患者血清hs-CRP、RF、抗CCP、ESR及DAS28評分、滑膜厚度、滑膜血流分級、滑膜動脈RI顯著高于緩解期患者，且緩解期患者各指標均顯著高于對照組，表明血清hs-CRP、RF、抗CCP、ESR、DAS28評分可用于RA的早期診斷和活動度評估，且超聲檢查對臨床診斷RA及疾病活動度評估也有一定價值。相關性分析結果顯示，miR-21與RA活動期患者hs-CRP、RF、ESR、DAS28評分、滑膜厚度呈負相關，表明外周血PBMC中miR-21水平有助于反映RA疾病活動度。ROC曲線分析顯示，miR-21截斷值為0.93時診斷RA活動期的敏感度和特異度均較高，提示檢測外周血PBMC中的miR-21有助于RA的早期診斷及活動度評估。

綜上所述，RA患者外周血PBMC中miR-21表達顯著降低，且與多種疾病活動度指標呈負相關，miR-21檢測有助于RA的診斷及疾病活動度評估。