ox-LDL誘導后SHP-2缺陷骨髓巨噬細胞脂肪沉積、吞噬功能及脂肪代謝基因表達觀察

梁雪雷，馬倩，李新新，譚鶴，張雪，帖彥清

(1河北北方學院，河北張家口075000；2河北省人民醫院)

動脈粥樣硬化(AS)相關的冠心病和腦卒中發病率較高，絕大部分患者是由高脂血癥誘發的AS。氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)是高脂狀態下衍生的導致AS的主要和特異性誘導物[1]。巨噬細胞是參與AS的關鍵細胞，可被動員、激活和趨化到AS部位，以清除動脈上異常沉積的脂質。然而，斑塊內巨噬細胞可通過吞噬ox-LDL形成泡沫細胞，進而引起一系列的炎癥、氧化應激反應，加速AS進展[2]。巨噬細胞源性泡沫細胞是AS特有的、最多的細胞類型[3]。蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-2是維持眾多類型細胞功能的關鍵基因[4]。關于SHP-2是否參與泡沫細胞形成，目前相關研究很少。2016年11月～2019年3月,本課題組繁育了骨髓巨噬細胞(BMDM)特異性SHP-2基因缺陷背景基因穩定型小鼠(SHP-2 MφCKO小鼠)，觀察了ox-LDL誘導后SHP-2 MφCKO小鼠BMDM脂肪沉積、吞噬功能及脂肪代謝相關基因表達的變化，探討SHP-2影響巨噬細胞脂代謝的機制。

1 材料與方法

1.1 動物及主要實驗材料 動物：SHP-2flox/flox小鼠購自美國Jackson實驗室，雌雄各8只，鼠齡4～6周；Lyz-2-Cre小鼠(利用Lyz-2啟動子構建的轉基因小鼠，能使83%～98%的成熟巨噬細胞發生基因重組)由路永剛博士贈與，雌雄各20只，鼠齡4～6周。主要實驗材料：胎牛血清(FBS,以色列BI公司)、Dil-ox-LDL(廣州奕源生物科技有限公司)、RPMI-1640培養基(美國Gibco公司)、單分散熒光微球(聚苯乙烯微球，Polysciences公司)、Gluta固定液(電鏡專用，4%，北京索萊寶科技有限公司)、快速DNA提取檢測試劑盒(KG203，北京天根生化科技有限公司)。

1.2 SHP-2 MφCKO小鼠的繁育與鑒定

1.2.1 SHP-2 MφCKO小鼠的繁育 將SHP-2flox/flox雌鼠與雄鼠一起合籠，順利繁育出F1代子鼠。用Lyz-2-Cre小鼠與F1代SHP-2flox/flox小鼠合籠，對得到的F2代小鼠進行基因型鑒定，篩選基因型為Cre×SHP-2flox/+的雜合子小鼠。將基因型為Cre×SHP-2flox/+的雜合子雌雄鼠合籠繼續繁殖，得到F3代小鼠，經鑒定篩選得到基因型為Cre×SHP-2flox/flox的小鼠即為實驗需要的純合子小鼠(SHP-2 MφCKO小鼠)[5,6]。

1.2.2 SHP-2 MφCKO小鼠的鑒定 取4～6周齡SHP-2 MφCKO小鼠，剪3 mm左右尾巴尖部，提取DNA，進行PCR擴增。SHP-2的loxp位點上游引物序列為5′-ATGACTCCTGAAGCCCATTG-3′，下游引物序列為5′-CTTCCCATCACCTCAGACTCC-3′；Lyz-2-Cre基因突變型引物序列為5′-CCCAGAAATGCCAGATTACG-3′，野生型為5′-TTACAGTCGGCCAGGCTGAC-3′，共有引物為5′-CTTGGGCTGCCAGAATTTCTC-3′。PCR反應體系包括DreamTaq Green PCR Master Mix(2×) 12.5 μL、上游引物和下游引物各1 μL、DNA模板0.5 μL、去核酶水10 μL。反應條件：初始變性95 ℃ 5 min，變性95 ℃ 30 s，退火65 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 18 s(SHP-2flox/flox)或42 s(Lys-2-Cre-/+)，重復30個循環；延伸72 ℃ 60 s。PCR產物于4 ℃保存，后進行瓊脂糖凝膠電泳。電泳圖700 bp處有條帶為Cre+小鼠，350 bp處有條帶為Cre-小鼠；僅320 bp處有條帶為SHP-2flox純合子小鼠(SHP-2flox/flox)即SHP-2 MφCKO小鼠，只有221 bp處有條帶為野生型小鼠(SHP-2+/+)，320 bp、221 bp處均有條帶為雜合子小鼠(SHP-2flox/+)。

1.3 動物分組、BMDM獲取及ox-LDL刺激方法 選取8～10周齡的雄性SHP-2 MφCKO小鼠(實驗組)和野生型小鼠(基因型SHP-2+/+，對照組)進行實驗。將小鼠引頸處死，浸泡在75%乙醇中消毒5 min，在超凈臺中暴露并分離小鼠股骨及脛骨，置于冰的PBS培養皿中。剝離肌肉組織，切除關節面，暴露骨髓腔，用注射器吸取RPMI-1640培養基沖洗骨髓腔，收集沖洗出來的細胞培養基懸液，1 000 r/min離心5 min。丟棄上清液，換含10% FBS、1%雙抗、50 ng/mL M-CSF的RPMI-1640培養基重懸，計數后鋪至T25培養瓶中，5% CO2、37 ℃條件下培養。將貼壁5 d后的BMDM用0.25%胰酶消化，加入含2% FBS的完全培養基制成細胞懸液備用。在新的6孔板各孔中央滴加300 μL的含2% FBS的完全培養基，用鑷子夾取無菌爬片，輕放于培養基上并按壓爬片使其不易浮起，在爬片上滴加500 μL的細胞懸液，置于5% CO2細胞培養箱孵育2 h，使細胞貼壁。每孔補加1 200 μL的含2% FBS完全培養基繼續孵育。8 h后每孔加0.25 μL的ox-LDL(終濃度為50 ng/mL)[7]。

1.4 BMDM脂滴沉積觀察 兩組BMDM用50 ng/mL的ox-LDL刺激48 h后，使用電鏡灌流固定液固定細胞，透射電鏡下觀察BMDM脂滴沉積情況。將BMDM與100 mg/L的Dil-ox-LDL(紅色熒光)共同孵育48 h后，用熒光顯微鏡照相，觀察泡沫細胞形成情況。

1.5 BMDM吞噬功能檢測 以ox-LDL刺激兩組BMDM的同時加入單分散綠色熒光聚苯乙烯微球1 μL(終濃度為0.5 μL/mL)，繼續孵育24 h后將爬片封片。使用激光共聚焦顯微鏡在488 nm處觀察BMDM對單分散熒光微球的吞噬情況，使用活細胞工作站檢測熒光強度，表示BMDM的吞噬功能。

1.6 BMDM中脂肪代謝相關基因檢測 ox-LDL刺激24 h后提取兩組細胞總RNA，按照逆轉錄試劑盒說明書將RNA逆轉錄為cDNA，進行實時熒光定量PCR反應。PCR反應體系20 μL，包括TB GreenPremix Ex TaqⅡ (Tli RNaseH Plus，2×)10 μL，上游引物和下游引物各0.8 μL，DNA模板2 μL，去核酶水6.4 μL。CD36上游引物序列為5′-TCATGCCAGTCGGAGACATGCTTA-3′，下游引物序列為5′-ACCTGTCTGTACACAGTGGTGCCT-3′。Toll樣受體(TLR)4上游引物序列為5′-TGAACGAGAGGATGCTGACTG-3′，下游引物序列為5′-GGAGGGGCCATTTTTAGTGC-3′。甾醇調節因子結合蛋白(SREBP)-1c上游引物序列為5′-GGAGCCATGGATTGCACATT-3′，下游引物序列為5′-ACGGACGGGTACATCTTTAC-3′。SREBP-2上游引物序列為5′-CACAATATCATTGAAAAGCGCTACC-3′，下游引物序列為5′-TTTTTCTGATTGGCCAGCTTCAGCA-3′。三磷酸腺苷結合盒轉運體A1(ABCA1)上游引物序列為5′-GGTTTGGAGATGGTTATACAATAGTTGT-3′，下游引物序列為5′-TTCCCGGAAACGCAAGTC-3′。三磷酸腺苷結合盒轉運體G1(ABCG1)上游引物序列為5′-AGGTCTCAGCCTTCTAAAGTTCCTC-3′，下游引物序列為5′-TCTCTCGAAGTGAATGAAATTTATCG-3′。內參β-actin上游引物序列為5′-GCAGGAGTACGATGAGTCCG-3′，下游引物序列為5′-ACGCAGCTCAGTAACAGTCC-3′。以2-ΔΔCt表示目的基因相對表達量。

2 結果

2.1 SHP-2 MφCKO小鼠的繁育及鑒定結果 繁育出Cre-小鼠36只，SHP-2 MφCKO小鼠53只，SHP-2+/+小鼠61只，SHP-2flox/+小鼠69只。不同小鼠基因型PCR鑒定情況見圖1。

注：A為Cre-小鼠；B為SHP-2 Cre+小鼠；C為SHP-2flox/+小鼠；D為SHP-2+/+小鼠。

圖1 小鼠基因型PCR鑒定情況

2.2 兩組小鼠BMDM中脂肪沉積情況比較 實驗組小鼠BMDM中脂滴成分量多、體積大，基本充滿細胞質，對照組BMDM中脂滴量少，體積小而且零散分散于細胞質中，見圖2。熒光顯微鏡觀察發現，實驗組細胞質內出現大量的紅色熒光顆粒(脂滴)，提示已經形成泡沫細胞，見圖3。實驗組、對照組BMDM中紅色熒光含量分別為1.93±0.27、0.83±0.03，兩組相比，P<0.05。

2.3 兩組BMDM吞噬功能比較 激光共聚焦顯微鏡下觀察發現，實驗組BMDM細胞內熒光微球的數量顯著增加(圖4)。實驗組、對照組BMDM內綠色熒光強度分別為1 297±17.14、454.5±24.75，兩組相比，P<0.05。

2.4 兩組BMDM中脂肪代謝相關基因表達比較

注：a為1 000×；b為3 000×。

圖2透射電鏡下兩組BMDM中脂滴沉積情況

注：a為明場視野；b為熒光視野。

圖3 熒光顯微鏡下兩組細胞質內紅色熒光顆粒情況

圖4 激光共聚焦顯微鏡下兩組BMDM內熒光微球數量

實驗組BMDM中CD36、TLR-4、SREBP-1c和SREBP-2 mRNA相對表達量高于對照組(P均<0.05)。詳見表1。

表1 實驗組、對照組BMDM中脂肪代謝相關基因表達比較

注：與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01。

3 討論

ox-LDL是高脂狀態下衍生的誘發AS的主要物質[1]。在AS進程中，循環中的單核-巨噬細胞首先被動員、激活和趨化到病變部位以清除動脈上異常沉積的脂質。巨噬細胞表達多種清道夫受體(SR)，主要負責吞噬修飾后的脂質如ox-LDL和乙酰化低密度脂蛋白，這是識別、吞噬脂蛋白及其攜帶的膽固醇成分的第一步，也是促進泡沫細胞形成的關鍵環節。進入巨噬細胞的多余脂質和膽固醇成分激活SREBP[8]后，使巨噬細胞內脂質堆積在胞質內形成巨噬細胞性泡沫細胞。多余的脂質聚集后激活膽固醇外排蛋白ABCA1、ABCG1，促進細胞內游離膽固醇酯和磷脂排出，結合細胞表面的載脂蛋白(Apo)A-I，最后通過HDL-C轉運至肝臟進行代謝[9]。

酪氨酸磷酸酶和激酶之間的平衡是維持細胞正常功能的支柱系統[10]，該系統失衡會導致炎癥反應過度、代謝失衡、免疫異常直至腫瘤等疾病[11]。最近研究顯示，巨噬細胞內酪氨酸激酶(SYK)升高可明顯促進膜表面CD36內化和CD36/TLR-4/TLR-6異源三聚體形成。SHP-2與SYK、布魯頓酪氨酸激酶(BTK)等的作用相互制約、拮抗且互為底物。圍繞SHP-2是否參與泡沫細胞形成這一課題，我們經過4年努力成功構建了SHP-2 MφCKO小鼠，而且由于SHP-2flox/flox和Lyz-M Cre小鼠背景不同，我們通過純化9代使所有子代小鼠基因型穩定，而后用ox-LDL刺激小鼠BMDM以便于研究SHP-2在巨噬細胞源性泡沫細胞中的作用。ox-LDL是促進AS的關鍵因子，由于受體識別位點構型改變，所以只能被巨噬細胞表面的SR和TLR家族識別，不能被肝臟細胞的LDL受體識別。ox-LDL攜帶大量膽固醇，在細胞內經過一系列代謝后形成大量膽固醇酯以脂滴形式儲存在胞內，進而形成泡沫細胞[12]。我們將BMDM饑餓處理8 h后給予50 ng/mL的ox-LDL和熒光微球共刺激24 h，分別檢測了BMDM吞噬熒光微球的熒光強度和數量，結果顯示，實驗組細胞質內脂滴和吞噬熒光微球的數量多于對照組，提示SHP-2基因缺陷明顯促進巨噬細胞源性泡沫細胞形成，巨噬細胞的吞噬功能進一步提高[13]。

CD36是巨噬細胞表面的重要SR-A家族受體，也是單核-巨噬細胞吞噬ox-LDL的主要受體[14]。CD36可以無限制地吞噬或攝取修飾后的LDL，而且不受負反饋抑制，造成細胞內膽固醇酯聚集最終形成泡沫細胞[15]。TLR-4也是ox-LDL受體，而且它與CD36關系密切，參與了CD36-TLR-4/TLR-6異源三聚體形成和內化ox-LDL[16]。因此，我們同時檢測了兩組BMDM中的CD36、TLR-4 mRNA，結果顯示，經50 ng/mL的ox-LDL刺激后，實驗組CD36、TLR-4 mRNA相對表達量高于對照組，提示BMDM吞噬能力明顯增強。SREBP家族是核轉錄因子，它能與脂質合酶基因的啟動子或增強子的固醇調節元件結合，激活靶基因轉錄，特異性調控膽固醇攝入及合成代謝[17]。目前，已知SREBP-1主要調節脂肪酸合成酶或硬脂酰輔酶A脫氫酶等下游基因轉錄合成，調控脂肪酸合成。SREBP-2通過調節β-羥基-β-甲戊二酸單酰輔酶A脫氫酶合酶及還原酶和低密度脂蛋白受體等的合成，從而調控膽固醇代謝。SREBP-1c和SREBP-2基因表達異?？蓪е露哒{節平衡失調，可導致胞內脂質、膽固醇大量沉積，促進泡沫細胞的形成。本研究結果顯示，SHP-2基因缺陷后SREBP過表達，提示膽固醇在胞內“消化”和“儲存”增強。巨噬細胞主要通過ABCA1和ABCG1將細胞內膽固醇排出至HDL后到達肝臟代謝[18,19]，但本研究發現兩組ABCA1、ABCG1 mRNA相對表達量差異無統計學意義，SHP-2基因缺陷并未影響ABCA1、ABCG1 mRNA的表達，提示SHP-2基因缺陷加速泡沫細胞形成可能與增強ox-LDL內化進入巨噬細胞、增強膽固醇或脂質的轉運有關[20]。

總之，本研究證實，SHP-2基因缺陷小鼠BMDM脂肪沉積加劇，細胞吞噬功能增強，脂肪代謝相關基因表達上調。SHP-2基因缺陷的BMDM可能通過促進吞噬ox-LDL并使其轉化為膽固醇酯等儲存于細胞內，從而促進泡沫細胞形成。檢測AS患者單核-巨噬細胞內的SHP-2蛋白可能有助于評估AS的進展。