羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖修飾的艾塞那肽固體脂質納米粒的制備及轉運能力評價

董晶劍，沈斌，肖艷萍，曹青日，施麗麗,

(1嘉興學院醫學院，浙江嘉興314001；2蘇州大學藥學院)

艾塞那肽是第一個人工合成的腸降血糖素類似物，由39個氨基酸組成[1]。艾塞那肽能促使葡萄糖依賴的胰島素分泌，延緩胃排空，改善胰腺β細胞功能[2,3]，治療2型糖尿病療效顯著，展現出良好的臨床應用前景[4]。作為多肽類藥物，艾塞那肽體內穩定性差，半衰期短，口服生物利用度低，目前臨床采用皮下注射給藥，然而頻繁注射造成患者順應性差，且皮下注射難以達到持續激活胰高血糖素1(GLP-1)受體的作用[5]，療效不持久。因此，研發長效口服制劑意義重大。由于口服吸收過程存在層層屏障，將艾塞那肽制成普通口服制劑缺乏可行性。將多肽類藥物包裹于納米給藥系統內，可增強其在胃腸道內的穩定性，顯著促進小腸上皮細胞對多肽類藥物的攝取，從而提高口服生物利用度[6,7]。固體脂質納米粒(SLNs)作為常用的納米給藥系統，具有生物相容性好、保護藥物免受胃腸道酶降解、促進藥物口服吸收等優勢，已成為生命科學領域的研究熱點[8]。已有研究表明，固體納米粒可明顯增強胰島素在胃腸道內的穩定性，提高其口服生物利用度[9,10]。2017年10月～2019年4月，本研究將艾塞那肽包裹于SLNs，以羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖(HACC)進行修飾，通過體外細胞實驗對其轉運能力進行初步評價。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 超聲波細胞粉碎儀(JY96-11N型，寧波新芝生物科技公司)，高分辨透射電鏡(TecnaiG220型，美國FEI公司)，激光粒度分析儀(HPP5001型，英國馬爾文公司)，超速離心機(OPTIMAL-90K型，美國BECKMAN公司)，跨膜電阻測定儀(Millicell-ERS型，美國密理博公司)。艾塞那肽[批號P141017-3-LP052143，吉爾生化(上海)有限公司]，單硬脂酸甘油酯(化學純，天津市科密歐化學試劑有限公司)，大豆磷脂(S100，上海艾韋特醫藥科技有限公司)，二氯甲烷(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)，HACC(南通綠神生物工程有限公司)，聚乙烯醇(Sigma公司)。人結直腸腺癌細胞株Caco-2及人B淋巴細胞瘤細胞株Raji B購自中國科學院上海細胞庫。

1.2 納米粒制備 采用復乳化溶劑揮發法制備納米粒。內水相：將30 mg艾塞那肽溶于1 mL水中。油相：20 mg大豆磷脂S-100溶于加有2 mL二氯甲烷的西林瓶內，70 ℃水浴下將60 mg單硬脂酸甘油酯盛于西林瓶內，將上述兩個西林瓶內油相混合得到均一油相。將水相快速加至油相，200 W超聲60 s得到初乳，將初乳迅速轉移到20 mL外水相(1% PVA)中，攪拌得復乳，室溫持續攪拌5 h去除有機溶劑，得到納米?；鞈乙?Exenatide-SLNs)。在納米?；鞈乙褐芯徛渭?.1% HACC水溶液，使Exenatide-SLNs混懸液與0.1% HACC修飾液體積比為1∶4[11,12]，200 W超聲90 s，室溫攪拌3 h，得到HACC修飾的艾塞那肽SLNs(HACC-Exenatide-SLNs)。

1.3 納米粒理化性質及載藥量檢測 取納米粒懸液，滴至覆有支持膜的銅網上，于紅外燈下烘干，采用高分辨透射電鏡觀察其形態。取適量納米粒懸液，以蒸餾水進行稀釋，激光粒度儀測其粒徑及表面電位。取0.1 mL納米粒懸液于2 mL EP管內，加入適量甲醇破乳，高速離心取上清，以HPLC法測定上清液中的艾塞那肽，即為W總。取0.1 mL納米粒懸液，外水相稀釋10倍后超速離心45 000 r/min、45 min。以HPLC法測定上清液中游離的艾塞那肽，即為W游離。按公式[13]計算載藥量。載藥量=(W總-W游離)/W載體×100 %。其中，W總為艾塞那肽總量，W游離為未載入納米粒的艾塞那肽，W載體為載體質量。

1.4 黏膜濾泡相關上皮(FAE)單層細胞模型建立 按文獻方法培養Caco-2、Raji B細胞并建立FAE模型[14]。FAE模型具體制作過程：Caco-2單層細胞培養13 d后，按1×106/mL在Millipore跨膜小室的BL側(基底側)加入Raji B細胞，AP側(腸腔側)每日更換培養基，BL側每日半量更換培養基，繼續培養至第19天，測定跨膜電阻值(TEER)[15]并檢測M細胞特異表達的UEA-1蛋白[16]。Caco-2單層細胞TEER>500 Ω/cm2，加入Raji B細胞后TEER約為Caco-2單層的60%，單層細胞表達UEA-1蛋白，表明已分化出M細胞，FAE模型建立成功。

1.5 藥物轉運率測算 PBS輕輕洗滌符合轉運條件的FAE模型，于37 ℃細胞培養箱中平衡0.5 h，吸走PBS；在供給池分別加入0.5 mL的艾塞那肽溶液(艾塞那肽溶液組)、Exenatide-SLNs混懸液(Exenatide-SLNs組)、HACC-Exenatide-SLNs混懸液(HACC-Exenatide-SLNs組)；在接收池中加入1.5 mL的HBSS溶液，孵育4 h；從供給池取0.1 mL樣品，接收池取0.2 mL樣品，進行液相分析。按照文獻方法計算藥物轉運率[17]。

1.6 緊密連接蛋白Claudin-1檢測 上述“1.5”藥物轉運實驗結束后，去除轉運液，FAE單層細胞用預冷的PBS洗滌3次，加入適量裂解液，冰上裂解，12 000 r/min、4 ℃條件離心30 min，取上清，BCA法蛋白定量，用PBS調整各樣品濃度，沸水浴進行蛋白變性。隨后進行SDS-PAGE凝膠電泳(80 V、1 h，120 V、2 h)，電泳結束后將進行轉膜(300 mA，1.5 h)，封閉1 h(5%脫脂奶粉)，TBST洗滌。加入多克隆兔抗Claudin-1于4 ℃過夜，TBST洗滌，加入山羊抗兔IgG，室溫下孵育1 h，TBST洗滌，掃描成像。以GAPDH為內參，未進行轉運實驗的FAE細胞單層作為空白對照(Control)。使用Image J分析蛋白條帶灰度值，表示目的蛋白相對表達量。

2 結果

2.1 納米粒形態及理化性質 電鏡觀察發現，Exenatide-SLNs形態近圓形(圖1A)；HACC-Exenatide-SLNs表面變粗糙，有殼聚糖鏈纏繞(圖1B)。HACC-Exenatide-SLNs組粒徑低于Exenatide-SLNs組，表面電位由負電位變為正電位，載藥量略低于Exenatide-SLNs組(P均<0.05)。見表1。

圖1 Exenatide-SLNs、HACC-Exenatide-SLNs電鏡下觀察形態

納米粒粒徑(nm)表面電位(mV)載藥量(%)Exenatide-SLNs226.3±19.8-24.2±2.53.1±0.2HACC-Exenatide-SLNs330.0±16.720.2±1.92.5±0.2

2.2 各組藥物轉運率 艾塞那肽溶液組、Exenatide-SLNs組、HACC-Exenatide-SLNs組藥物轉運率分別為0.27%±0.07%、1.35%±0.11%、2.05%±0.08%，Exenatide-SLNs組、HACC-Exenatide-SLNs組藥物轉運率高于艾塞那肽溶液組，且HACC-Exenatide-SLNs組高于Exenatide-SLNs組(P均<0.01)。

2.3 各組細胞中緊密連接蛋白表達比較 艾塞那肽溶液組、Exenatide-SLNs組、HACC-Exenatide-SLNs組細胞中Claudin-1相對表達量分別為1.100 5±0.088 2、1.001 7±0.153 8、0.628 4±0.043 9，HACC-Exenatide-SLNs組Claudin-1相對表達量低于艾塞那肽溶液組、Exenatide-SLNs組(P均<0.05)。

3 討論

艾塞那肽是一種蛋白多肽類藥物，具有很好的治療2型糖尿病的前景。如何選擇合適、高效的給藥途徑是蛋白多肽類藥物開發過程中至關重要的問題。目前蛋白多肽的給藥方式主要是注射給藥，然而頻繁注射給患者帶來諸多不便及痛苦。將蛋白多肽類藥物制成口服制劑，可避免注射給藥的痛苦。但蛋白多肽類藥物分子量大，脂溶性低，物理穩定性差，難以透過腸道細胞膜，且易被胃腸道內酸和消化酶分解，吸收后易受肝臟首過效應，因而將蛋白多肽藥物制備成普通口服制劑無法發揮療效。SLNs具有穩定性高、適用于多種給藥途徑、具有淋巴吸收可避開首過效應等優勢，將蛋白多肽類藥物制備成口服SLNs具有廣闊的開發前景。

本研究制備了艾塞那肽SLNs，并用HACC對其進行表面修飾。HACC能溶于任意pH值水溶液[18]，由于小分子季銨鹽的存在，HACC具有較強的質子化能力、黏膜黏附性能及打開緊密連接的能力。本課題組前期實驗從SLNs混懸液與HACC修飾液的比例、超聲時間及修飾后攪拌時間三個方面優化了HACC修飾工藝。體積比對粒徑有一定影響；超聲可降低粒徑，可能與超聲促使殼聚糖鏈相互纏繞而緊密包裹于SLNs周圍相關；攪拌過程對經HACC修飾的SLNs粒徑有微小的影響，殼聚糖長鏈的纏繞及解聚是一個動態平衡過程。

FAE是體外模擬小腸的一種細胞模型，是將Caco-2細胞與Raji B細胞共孵育，繼而分化出M細胞所得。與Caco-2細胞模型相比，FAE模型中M細胞頂端缺乏黏液層，有利于外源物質胞內轉運。Shi等[13]將低生物膜透過性藥物扎那米韋包裹于以單硬脂酸甘油酯為類脂質的SLNs中，旨在提高其口服生物利用度，但研究結果表明該納米粒較難通過Caco-2單層膜，認為Caco-2單層膜模擬小腸具有一定局限性。因此,有必要使用FAE模型研究納米給藥系統的吸收作用。本研究采用FAE模型對艾塞那肽納米粒轉運能力進行初步評價。結果顯示，將艾塞那肽制備成SLNs可明顯促進其跨FAE單層的轉運能力，SLNs表面吸附HACC，藥物的轉運量進一步增加。分析其原因，HACC具有黏膜黏附性能，可延長藥物與細胞的接觸時間，促進藥物跨細胞轉運；同時HACC具有打開細胞緊密連接的功能，因此能從細胞旁路途經促進藥物的轉運。緊密連接是由一系列蛋白組成的復合物，緊密連接的打開有助于促進藥物從旁路途徑的轉運[19,20]。本研究結果顯示，HACC-Exenatide-SLNs組Claudin-1相對表達量低于艾塞那肽溶液組、Exenatide-SLNs組，表明HACC修飾的納米?？纱龠M細胞旁路途徑轉運。

SLNs可增加藥物跨膜能力，這對艾塞那肽口服制劑的開發具有重要價值。然而，本研究僅從體外對納米粒的性質、轉運能力進行觀察，缺乏對其體內應用效果的評價，后續將通過動物模型評價艾塞那肽SLNs的體內降糖效果，為其進一步臨床應用提供更多的理論依據。