五味子乙素對高糖誘導的人臍靜脈內皮細胞衰老的影響及機制

仲維莉，鄒國良，徐洪濤

(1黑龍江中醫藥大學，哈爾濱150040；2黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院)

高血糖癥是動脈粥樣硬化發生發展的主要因素之一，糖尿病患者發生大血管并發癥是非糖尿病人群的2～4倍。高血糖導致的氧化應激增強是糖尿病大血管病變的發病基礎。高糖還可加速內皮細胞衰老，而衰老所導致的血管內皮細胞功能障礙是動脈粥樣硬化早期的關鍵環節[1]。五味子乙素為中藥北五味子主要有效成分之一，部分研究表明五味子乙素具有抗氧化應激、降糖、抗炎、抗腫瘤等多種藥理作用。本課題組曾構建急性高糖誘導的內皮細胞衰老模型，觀察到隨著糖濃度增加及作用時間延長，內皮細胞呈現顯著衰老特征，而L-精氨酸可以延緩高糖誘導的內皮細胞衰老，該作用與上調PI3K/Akt通路、增強端粒酶活性、修復氧化應激損傷有關；同時亦可促使內皮型一氧化氮合酶(eNOS)蛋白磷酸化，減輕活性氧簇(ROS)造成的氧化應激損傷，進而達到抗細胞衰老的作用。基于以上研究基礎，2014年6月～2017年12月，本研究觀察了不同濃度五味子乙素對高糖誘導人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)的抗衰老作用，并探討抗衰老作用是否與增強細胞抗氧化應激能力有關，為防治糖尿病大血管病變中藥單體的研發提供基礎實驗依據。

1 材料與方法

1.1 細胞與主要實驗材料 HUVEC(C-003-5C)第3～4代，培養液含有100 μg/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素、10%胎牛血清的DMEM，于培養條件為5% CO2、37 ℃的細胞孵育箱中培養。每24～48 h換培養液1次，以保證細胞具有良好的生長狀態。DMEM培養基(高糖)，胰蛋白酶，胎牛血清，D-葡萄糖，碘化丙啶(PI)，細胞衰老β-半乳糖苷酶(SA β-gal)染色試劑盒，ROS檢測試劑盒，總一氧化氮(NO)檢測試劑盒。CO2培養箱，倒置相差熒光顯微鏡，酶聯免疫檢測儀，全自動流式細胞儀，低溫離心機。

1.2 細胞分組及給藥方法 用0.25%胰蛋白酶消化HUVEC，待細胞生長至對數生長期(即80%融合時)進行傳代。將HUVEC分為6個組。正常組給予5.5 mmol/L D-葡萄糖；高糖組給予25 mmol/L D-葡萄糖；五味子乙素1組給予25 mmol/L D-葡萄糖和5 μmol/L五味子乙素；五味子乙素2組給予25 mmol/L D-葡萄糖和10 μmol/L五味子乙素；五味子乙素3組給予25 mmol/L D-葡萄糖和15 μmol/L五味子乙素；五味子乙素4組給予25 mmol/L D-葡萄糖和20 μmol/L五味子乙素。各組細胞傳代20代后進行后續檢測。

1.3 細胞衰老評估 采用衰老相關的SA β-gal染色法評估細胞衰老情況，按試劑盒說明書操作，以SA β-gal染色陽性細胞(即衰老細胞)數占細胞總數的百分比表示細胞衰老情況。

1.4 細胞周期檢測 取各組細胞，采用PI法流式細胞儀分析各組細胞周期。

1.5 細胞內ROS檢測 取各組細胞，采用ROS檢測試劑盒檢測細胞內的ROS水平。

1.6 細胞內總NO檢測 取各組細胞,采用Griess reagent法測算細胞內NO水平。

2 結果

2.1 各組衰老細胞百分比比較 正常組、高糖組、五味子乙素1組、五味子乙素2組、五味子乙素3組、五味子乙素4組衰老細胞百分比分別為4.18%±0.27%、5.76%±0.31%、5.28%±0.39%、4.98%±0.20%、4.87%±0.37%、4.36%±0.34%。高糖組、五味子乙素1組、五味子乙素2組、五味子乙素3組衰老細胞百分比高于正常組；五味子乙素各組衰老細胞百分比低于高糖組；五味子乙素不同濃度組間差異均有統計學意義(P均<0.01)。

2.2 各組細胞周期比較 高糖組、五味子乙素1組、五味子乙素2組、五味子乙素3組G0/G1期細胞比例高于正常組，S期細胞比例低于正常組；五味子乙素各組G0/G1期細胞比例低于高糖組，S期細胞比例高于高糖組；五味子乙素不同濃度組間差異均有統計學意義(P均<0.01)。詳見表1。

表1 各組細胞周期分布比較

注：與正常組比較,﹡P<0.01；與高糖組比較，﹟P<0.01。

2.3 各組細胞中ROS水平比較 正常組、高糖組、五味子乙素1組、五味子乙素2組、五味子乙素3組、五味子乙素4組細胞中ROS水平分別為251.63±15.04、495.82±10.39、421.71±9.09、363.06±17.88、292.67±12.27、264.74±14.38。高糖組、五味子乙素1組、五味子乙素2組、五味子乙素3組ROS水平高于正常組；五味子乙素各組ROS水平低于高糖組；五味子乙素不同濃度組間差異均有統計學意義(P均<0.01)。

2.4 各組細胞中NO水平比較 正常組、高糖組、五味子乙素1組、五味子乙素2組、五味子乙素3組、五味子乙素4組細胞中NO水平分別為(24.05±1.61)、(5.90±0.89)、(8.13±0.82)、(13.15±1.46)、(14.7±1.35)、(17.83±1.14)μmol/L。高糖組、五味子乙素1組、五味子乙素2組、五味子乙素3組NO水平低于正常組；五味子乙素各組NO水平高于高糖組；五味子乙素不同濃度組間差異均有統計學意義(P均<0.01)。

3 討論

糖尿病大血管病變是2型糖尿病致殘、致死的主要原因。關于糖尿病大血管病變的防治目前仍處于控制相關危險因素的階段，缺乏特異性的藥物延緩其發生發展。近年來研究顯示，內皮細胞功能障礙是糖尿病患者發生大血管病變的始動環節，而內皮細胞衰老是內皮完整性缺失進而發生血管并發癥的關鍵因素，因此，延緩內皮細胞衰老將成為防治糖尿病大血管病變的新靶點。

關于細胞衰老的機制至今尚未完全明確，但目前公認的是端粒-端粒酶學說及氧化應激學說。細胞衰老是指年齡相關的細胞固有功能喪失，分為復制性衰老及非復制性衰老。目前復制性衰老研究較多，主要由于細胞有絲分裂中復制或增殖壓力導致的DNA損傷反應等復制障礙，引起細胞周期阻滯，其特殊形式是應激引起的早衰老。糖尿病大血管病變即屬于高糖致氧化應激損傷導致的血管內皮細胞的早衰老。許多證據表明，細胞核內端粒結構和功能與衰老密切相關，隨著細胞分裂周期性、漸進性損耗，最終引起細胞復制性衰老，而不單純依賴于端粒的長度[2～4]。端粒酶是在細胞中負責延長端粒的一種酶，是一種核糖核蛋白，以自身RNA模板合成端粒DNA，為細胞持續分裂提供遺傳基礎。一些研究表明，端粒酶可通過維持端粒長度、結構及功能來延緩細胞衰老[5,6]。高糖致氧化應激損傷促進內皮細胞功能障礙是細胞衰老的主要原因之一[7]。Unterluggauer等[8]及本課題組前期研究[9]均報道,HUVEC衰老后，細胞周期分布特點是隨著葡萄糖濃度增加，G0/G1期的HUVEC比例逐漸增加，而S期HUVEC比例逐漸減少，糖濃度對細胞周期的影響具有時間依賴性，這表明細胞增殖能力隨著葡萄糖濃度的升高而下降，進一步證實高糖加速了HUVEC衰老的進程。

氧化應激損傷增強與NO生物利用度下降在內皮細胞衰老中起著至關重要的作用[10，11]。NO與過量ROS反應而減輕細胞氧化應激損傷的程度。NO具有抗凋亡、抑制平滑肌細胞增殖、抗血小板聚集、抗白細胞黏附及調節血管管腔大小等多種作用，在抗動脈粥樣硬化過程中發揮十分重要的作用[12～14]。本研究結果顯示，HUVEC傳代20代后正常組細胞仍維持較好的細胞增殖狀態，SA β-gal染色陽性細胞比例<5%;而高糖組細胞周期阻滯在G0/G1期，SA β-gal染色陽性細胞比例增多，ROS水平升高，NO水平明顯下降。這說明長期慢性高糖刺激后細胞氧化應激損傷加重，不僅使NO功能下降，同時可能使端粒酶活性下降、無法修復因應激損傷，導致端粒縮短，進而發生內皮細胞過早衰老。

五味子乙素為北五味子的主要有效成分之一，具有多種藥理作用，其中抗氧化應激損傷是其非常重要的藥理作用。生物體中的自由基主要是氧自由基(如超氧陰離子自由基、羥自由基)。過多的氧自由基在體內大量堆積可引起細胞毒性作用，造成蛋白、脂質、DNA等生物大分子損傷，從而引起多種疾病[15]，如心臟病、阿爾茨海默病、帕金森病和腫瘤。研究顯示，五味子乙素可通過直接清除氧自由基[16]、提高抗氧化酶活性[17]、提高體內谷胱甘肽過氧化物酶(GSH)的含量[18]、降低MDA和LDH水平[19]、減少ROS的產生[20]而發揮抗氧化作用。本研究采用四種不同濃度的五味子乙素作用于高糖誘導的HUVEC，結果顯示5～20 μmol/L的五味子乙素呈劑量依賴性延緩HUVEC衰老，表現為SA β-gal染色陽性細胞比例降低，G0/G1期細胞比例減少，細胞內ROS水平降低，NO水平增高，尤其是20 μmol/L的五味子乙素抗衰老作用最為明顯。在后續實驗中我們將進一步增加五味子乙素的劑量，以篩選抗衰老作用最佳的藥物濃度，篩選適合長期補充、發揮抗內皮細胞衰老作用的有效劑量，以延緩糖尿病并發癥的發生發展。

綜上所述，五味子乙素可延緩高糖誘導的HUVEC衰老進程，作用呈劑量依賴性。這種抗衰老作用可能與減輕氧化應激損傷、增加NO生物利用度、增強端粒酶活性進而修復端粒的作用有關。我們推測五味子乙素通過調節NO的合成，減少ROS的產生，減輕氧化應激損傷，延緩因氧化應激而加速的細胞復制性衰老進程；而氧化應激損傷減輕則可增強端粒酶的活性，發揮其延長端粒長度及修復端粒功能的作用，進而延長細胞的壽命，保持細胞增殖潛能，延緩細胞衰老進程。我們將在后續研究中進一步探討五味子乙素是否可通過調節PI3K/Akt通路、調節端粒酶活性及減輕氧化應激損傷而達到抗HUVEC衰老的作用。