丹蛭降糖膠囊治療大鼠糖尿病牙周炎的效果及牙周組織中骨鈣素表達變化

董蕾，方朝暉，徐培

(1安徽醫學高等專科學校，合肥230601；2安徽中醫藥大學第一附屬醫院)

牙周炎是由牙菌斑引起，以牙周組織漸進性附著喪失和骨吸收為特征的口腔常見疾病，最終可導致牙齒喪失。牙周炎作為糖尿病并發癥之一，逐漸受到廣大學者的關注。近年來，多項研究逐漸證實牙周炎與糖尿病之間的雙向關系[1，2]，即糖尿病增加了牙周組織對牙菌斑的易感性，引起牙周炎的發生發展；同時牙周炎對糖尿病的代謝調控也有負面影響，控制牙周炎癥有助于調節糖尿病患者的血糖。骨鈣素(BGP)作為新型骨轉換和骨形成的特異性標志物，在骨鈣代謝中起重要的調節作用，其水平反映成骨細胞活性。近年來研究顯示，骨鈣素可能通過改善胰島素抵抗、促進胰島素分泌等途徑參與糖代謝調節[3，4]。丹蛭降糖膠囊(DJC)具有益氣、養陰、活血功效，在降低血糖、血脂、調控炎癥因子、防治糖尿病血管并發癥等方面具有顯著效果[5]。2015～2018年本研究觀察了DJC治療大鼠糖尿病牙周炎的效果及牙周組織中BGP表達變化，初步探討DJC在糖尿病牙周炎治療方面的臨床應用前景。

1 材料與方法

1.1 動物與主要實驗材料 清潔級健康雄性Wistar大鼠80只[許可證號SCXK(京)2016-0002]，10周齡，體質量(250±20)g，由北京思北福生物有限公司提供。DJC由安徽中醫藥大學第一附屬醫院內分泌科提供。鏈脲佐菌素(STZ)購于Sigma公司。TRIzol試劑購于Invitrogen公司(批號10296028)。Ultra Pure Agarose、SuperScript Ⅲ RT反轉錄kit、Sybr qpcr mix購于ABI-invitrogen公司。計算機病理圖像采集與分析系統(LEICA公司，型號4000B)，臺式高速冷凍離心機(THERMO公司，型號LEGEND MICRO 21R)，核酸濃度測定儀(THERMO公司，型號Nanodrop little)，qPCR儀(Applied biosystems公司，型號7900 Fast)，電泳儀、凝膠成像儀(Biorad公司，型號EPS 300、2500)。

1.2 動物分組、模型制作及給藥處理 選擇健康雄性大鼠80只，適應性喂養7 d后隨機選擇20只作為健康對照組(CTL組)，給予正常基礎飼料喂養。其余60只大鼠給予高脂高糖飼料喂養，4周后腹腔注射45 mg/kg STZ誘導糖尿病，注射3 d后取尾靜脈測空腹血糖及尿糖；連續3 d 空腹血糖≥15 mmol/L、尿糖達+++、第7天空腹血糖≥16.7 mmol/L則視為糖尿病模型制作成功。糖尿病建模成功后1周，給予腹腔注射10 g/L戊巴比妥鈉麻醉，采用0.2 mm正畸結扎鋼絲結扎雙側上頜第一磨牙牙頸部，要求鋼絲位于齦溝內但不損傷結合上皮。建模成功標準：上頜第一磨牙組織切片可見結合上皮根向增殖，形成牙周袋，牙齦組織內炎癥細胞浸潤，膠原纖維紊亂，牙槽嵴吸收等。將60只建模成功的糖尿病牙周炎大鼠隨機分成糖尿病牙周炎對照組(DP組)20只、牙周基礎治療組(DP+BT組)20只、牙周基礎治療加DJC組(DP+BT+DJC組)20只。DP+BT組和DP+BT+DJC組大鼠在麻醉下行牙周基礎治療：常規實施潔治術以消除菌斑和結石，3%雙氧水沖洗牙周袋后注入少許1%碘甘油。DP+BT+DJC組大鼠行牙周基礎治療后以DJC灌胃，根據大鼠等效劑量計算并給予DJC 0.47 g/(kg·d)，連續給藥2個月。CTL組、DP組和DP+BT組用等體積的生理鹽水灌胃，連續用藥2個月。

1.3 血糖檢測 給藥2個月后進行尾靜脈采血，測空腹血糖。

1.4 牙齦炎癥程度評估 處死大鼠后截取包括第一磨牙的雙側上頜骨，部分組織立即放入-80 ℃液氮中冷凍備用。另一部分組織經固定、脫鈣，常規石蠟包埋，沿牙體長軸近遠中向制作成5 μm厚的組織切片，進行HE染色。通過計算機病理圖像采集與分析系統，選擇第一磨牙近中牙齦上皮層和固有層內45 μm×70 μm視野中的炎癥細胞(單核細胞和淋巴細胞)計數，以量化牙齦組織的炎癥程度。

1.5 牙周組織BGP mRNA檢測 取包括第一磨牙的上頜骨組織，提取總RNA，使用反轉錄試劑盒將總RNA進行反轉錄為cDNA，再進行RT-qPCR擴增，以GAPDH為內參。根據NCBI檢索目的基因全長堿基序列，應用Primer Premier6.0軟件設計PCR特異性引物，送北京梓熙生物公司合成。BGP mRNA上游引物序列為5′-ATTGTGACGAGCTAGCGGAC-3′、下游引物序列為5′-TCGAGTCCTGGAGAGTAGCC-3′，GAPDH上游引物序列為5′-GTTACCAGGGCTGCCTTCTC-3′、下游引物序列為5′-GGGTTTCCCGTTGATGACC-3′。以2-ΔΔCt表示BGP mRNA相對表達量。

2 結果

2.1 各組大鼠血糖水平比較 CTL組、DP組、DP+BT組、DP+BT+DJC組血糖水平分別為(5.67±0.91)、(19.44±2.73)、(13.74±2.31)、(7.78±2.34)mmol/L，DP+BT組、DP+BT+DJC組血糖水平低于DP組，但仍高于CTL組,DP+BT+DJC組低于DP+BT組(P均<0.05)。

2.2 各組大鼠牙齦組織炎癥程度比較 CTL組、DP組、DP+BT組、DP+BT+DJC組第一磨牙近中牙齦上皮層和固有層內炎癥細胞計數分別為(4.02±0.70)、(23.1±1.3)、(19.7±1.1)、(13.7±2.4)個，DP+BT+DJC組炎癥細胞計數低于DP組和DP+BT組，但仍高于CTL組(P均<0.05)。見圖1。

圖1 各組大鼠牙齦組織中炎癥細胞浸潤情況

2.3 各組大鼠牙周組織中BGP mRNA表達比較 CTL組、DP組、DP+BT組、DP+BT+DJC組牙周組織中BGP mRNA相對表達量分別為1.00±0.00、0.60±0.12、0.84±0.02、1.00±0.02。DP組、DP+BT組牙周組織中BGP mRNA相對表達量低于CTL組(P均<0.05)，DP+BT+DJC組牙周組織中BGP mRNA相對表達量高于DP組、DP+BT組(P均<0.05)。

3 討論

長期高血糖狀態可危及多種組織，特別是眼、腎、心臟、血管、神經等，發生各類糖尿病并發癥。牙周炎是常見的牙周支持組織的慢性炎癥，炎癥逐漸累及牙齦、牙周膜、牙槽骨和牙骨質，最終導致牙齒松動脫落，發病率高，危害大。革蘭陰性厭氧菌為主的牙菌斑為牙周炎的始動因子，食物嵌塞、咬合創傷等為促進因素，而糖尿病等全身因素與牙周炎有關[6]。近年來，關于牙周炎與糖尿病之間的關系研究較多。現已證實，糖尿病可增加牙周炎的易感性，機制包括：①高血糖減少唾液分泌量，改變唾液成分，從而改變牙周菌群；②高血糖造成白細胞趨化和吞噬功能缺陷，降低患者抗感染能力[7，8]；③高血糖改變牙周血管狀態，導致組織修復能力和再生力下降[9]；④高血糖抑制成纖維細胞和成骨細胞的活力，導致牙周附著喪失、牙槽骨吸收增加等，加重對牙周組織的破壞[10]。另一方面，持續發展的牙周炎不利于血糖控制，牙周治療對血糖控制具有積極作用[8]。

糖尿病屬中醫“消渴病”范疇。糖尿病慢性并發癥如牙周炎等的病因病機中，氣陰兩虛為本，氣滯、痰濁、瘀血為標，為本虛標實之證，故采取益氣健脾、滋陰生津、補益肝腎以治本，活血化瘀、化痰瀉濁、理氣以治標。臨床實踐發現，益氣養陰、活血化瘀治療不僅可以明顯改善糖尿病慢性并發癥的癥狀，也可以降低血糖、調整血脂代謝、改善微循環等。DJC具有益氣養陰、活血通脈功效，其具體組方為太子參18 g、生地黃15 g、丹皮12 g、菟絲子12 g、澤瀉9 g、水蛭9 g，共六味藥物。臨床及實驗研究均提示，DJC能改善糖尿病機體的糖尿病胰島素抵抗，保護胰島β細胞功能，清除氧自由基，保護氧化應激損傷組織，具有良好的降糖作用。

本研究結果顯示，DP+BT組、DP+BT+DJC組血糖水平低于DP組，高于CTL組，且DP+BT+DJC組低于DP+BT組；DP+BT+DJC組炎癥細胞計數低于DP組、DP+BT組。糖尿病牙周炎大鼠牙周組織內牙齦附著根方分離，膠原纖維水腫變性，排列紊亂，大量炎癥細胞浸潤；DJC治療后牙齦上皮完整，結合上皮附著基本正常，纖維排列清楚，炎癥減輕。這表明，DJC可降低糖尿病牙周炎大鼠血糖水平，同時控制牙周炎癥，牙周組織的炎癥控制與血糖控制情況基本一致。研究也表明，控制血糖可減輕糖尿病對牙周組織的破壞，提高局部抗感染能力[11]，增強牙周組織的修復能力和再生力，延緩牙周附著喪失和牙槽骨吸收。

BGP是一種由成骨細胞、成牙質細胞等合成的維生素K依賴性鈣結合蛋白，屬于非膠原酸性糖蛋白，在骨鈣代謝中起重要調節作用，是骨轉換和骨形成的特異性標志物。糖脂代謝紊亂是糖尿病的典型特征，可影響非膠原酸性糖蛋白的形成，從而抑制成骨細胞、成牙骨質細胞等的活性，導致骨代謝異常，骨密度降低[12～14]。同時，骨骼通過分泌BGP，可調節胰島素的分泌。有研究發現，糖尿病患者血清BGP水平過低可導致胰島素敏感性、葡萄糖耐量降低，從而加重病情[15]。有學者[16]研究認為，BGP水平變化可能直接反映藥物對牙槽骨的骨形成和骨重建的影響。本研究結果顯示，DP組、DP+BT組牙周組織中BGP mRNA相對表達量低于CTL組，DP+BT+DJC組牙周組織中BGP mRNA相對表達量高于DP組、DP+BT組。由上述結果可見，DJC干預了BGP mRNA的表達。推測糖尿病牙周炎大鼠通過活化炎癥、炎癥細胞釋放各種細胞因子如IL-6等打破了破骨細胞和成骨細胞之間的平衡，致使骨代謝異常[17～20]。給予DJC治療后，不僅病理改變顯著，并且BGP表達明顯提高，再次表明DJC具有減輕牙周組織細胞損傷、上調BGP表達、控制局部炎癥的效果。上調牙周組織內BGP表達,有望成為治療糖尿病牙周炎的新方向。

綜上所述，DJC治療大鼠糖尿病牙周炎可降低血糖水平，減輕牙齦組織炎癥程度，上調BGP mRNA的表達。本研究結果為DJC防治糖尿病牙周炎提供了一定的實驗依據。