2型糖尿病并發冠心病患者血漿miRNA-let7家族表達變化及診斷價值分析

杜開慧，陳龍，張斌強，徐先琳，陳琴華，陳繼舜

(1錦州醫科大學國藥東風總醫院研究生培養基地，湖北十堰442008；2湖北醫藥學院附屬國藥東風總醫院；3武當中藥特色研究湖北省重點實驗室)

2型糖尿病(T2DM)患者常合并心、腦、腎、眼等多器官損害，其中心血管損害是T2DM患者死亡的主要原因。研究表明，T2DM患者心血管疾病死亡風險是非糖尿病患者的2～3倍[1]。目前普遍認為，血糖控制達標的患者，冠心病(CHD)發病率相對減少；但我們在臨床工作中發現，部分血糖控制不佳的患者冠狀動脈血管情況較好，而部分血糖控制較好的患者冠狀動脈血管情況較差。鑒于此，我們推測，T2DM并發CHD可能與某些基因表達變化有關。微小RNA(miRNA)作為小的非編碼RNA分子，通過調節轉錄后水平的基因表達，在許多疾病發病和進展中起著重要作用。研究發現，miR-100、miR-let7、miR-21、miR-92a、miR-223在有T2DM并發癥患者及CHD患者的血漿中均有異常表達[2～7]，其中，miR-let7家族在動脈粥樣硬化和糖尿病相關內皮細胞功能障礙、血管平滑肌細胞增殖和炎癥反應的過程中有著至關重要的作用[2]。因此，miR-let7家族表達與T2DM并發CHD可能有一定聯系。本研究觀察了T2DM并發CHD患者血漿miR-let7家族的表達變化，分析miR-let7對T2DM并發CHD的診斷價值。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2018年4～12月在我院心內科和內分泌科住院患者224例(男124例、女100例)，其中，單純T2DM患者76例為T2DM組，男40例、女36例，糖尿病病程(5.8±1.3)年；T2DM合并CHD患者60例為T2DM+CHD組，男36例、女24例，糖尿病病程(6.1±1.7)年。另選擇88例年齡、性別相匹配的健康體檢者為對照組，男48例、女40例。排除1型糖尿病、惡性腫瘤、重要臟器嚴重功能障礙、急性心包炎及心肌炎、先天性心臟病、心律失常、免疫系統疾病、肺動脈栓塞、結締組織病、腦血管病及急慢性感染患者。本研究通過醫院倫理委員會批準，研究對象均知情同意。三組性別、年齡資料具有可比性，T2DM組與T2DM+CHD組糖尿病病程差異無統計學意義。

1.2 血漿miR-let7檢測 所有研究對象晨起使用EDTA抗凝管采空腹靜脈血5 mL，充分混勻后置于4 ℃冰箱，4 h內分離血漿，2 000 r/min離心5min，分離血漿，用TRIzol Reagent LS提取總RNA，置于-80 ℃冷凍保存。使用miSceipt Ⅱ RT Kit(50)試劑盒進行逆轉錄，總反應體系共20 μL：5×miScript HiSpec Buffer 4 μL，10×Nucleics Mix 2 μL，RNase-free Water 4 μL， miScript Reverse Transcriptase Mix 2 μL，Template RNA 8 μL。全過程需在冰上操作，逆轉錄產物加180 μL的DEPC水稀釋，-20 ℃保存。待測miR-let7家族引物序列見表1。內參為miR-423。使用美國miSriptR SYBRR Green PCR Kit(200)試劑盒。PCR反應體系包括2×QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix 12.5 μL、10×miScript Universal 2.5 μL、10×miScript Primer Assay 2.5 μL、RNase-free Water 1.5 μL、Template cDNA 1 μL。反應條件為95 ℃ 10 min起始模板預變性，94 ℃ 15 s模板變性，55 ℃ 30 s退火，70 ℃ 30 s延伸，循環40次。采用博日實時熒光定量PCR儀測定Ct值，以2-ΔΔCt表示miR-let7相對表達量。

表1 待測miR-let7家族引物序列

2 結果

2.1 各組血漿miR-let7家族表達比較 各組血漿miR-let7a-1、miR-let7a-2、miR-let7a-3、miR-let7c、miR-let7d、miR-let7e表達水平差異無統計學意義(P均>0.05)。T2DM+CHD組患者血漿miR-let7b、miR-let7i相對表達量高于T2DM組，miR-let7g、miR-let7f-1相對表達量低于T2DM組(P均<0.01)。見表2。

表2 各組血漿miR-let7家族表達比較

2.2 血漿miR-let7對T2DM及T2DM并發CHD的診斷效能 miR-let7b、miR-let7f-1、miR-let7g、miR-let7i診斷T2DM的ROC曲線下面積(AUC)分別為0.937 8(95%CI0.846 6～1.029 0，P<0.01)、0.997 6(95%CI0.989 8～1.005 0，P<0.01)、0.839 7(95%CI0.706 3～0.973 1，P<0.01)、0.925 4(95%CI0.850 4～1.020 0，P<0.01)；miR-let7b、miR-let7f-1、miR-let7g、miR-let7i診斷T2DM+CHD的AUC分別為0.809 1(95%CI0.846 6～1.029 0，P<0.01)、0.872 7(95%CI0.732 2～1.013 0，P<0.01)、0.751 5(95%CI0.558 8～0.944 2，P<0.01)、0.812 1(95%CI0.645 2～0.979 1，P<0.01)。見圖1。

注：a為miR-let7b的ROC曲線;b為miR-let7f-1的ROC曲線;c為miR-let7g的ROC曲線;d為miR-let7i的ROC曲線。

圖1 血漿miR-let7診斷T2DM及T2DM并發CHD的ROC曲線

3 討論

T2DM合并CHD患者常表現為多支、彌漫病變，病情更重，預后更差，對患者生命造成嚴重威脅[8]。CHD是T2DM最常見的大血管并發癥。冠狀動脈造影檢查是診斷CHD的惟一金標準，但檢查費用高、創傷大、臨床并發癥較多，一般不作為體檢常規項目。因此需要積極尋找新的生物標志物，為T2DM合并CHD尋找早期的預測指標，對危險因素盡早進行干預。miRNA是一類長度為21～25個核苷酸的內源性非編碼RNA，主要通過堿基配對與靶基因的3′UTR結合，促進靶基因的降解或抑制轉錄后翻譯。近年來，miR-let7在心血管疾病和糖尿病中的作用受到了廣泛關注，其在血管平滑肌細胞[9]、內皮細胞[10]、心肌細胞[11,12]和冠狀動脈平滑肌細胞[13]中均高表達。有研究表明，miRNA在糖尿病的代謝和抗血管形成的表觀遺傳調控中具有重要作用，且可能與糖尿病并發癥有關[14]。因此，我們推測miR-let7在T2DM并發CHD的病理過程中起重要作用。

在缺氧誘導下，HIF1α-let7b-Ago1-VEGF信號通路可促進新生血管的形成，從而促進動脈粥樣硬化的形成[15]。Roitbak等[15]發現，當小鼠體內miR-let7i表達降低時，IGF-1R受到抑制，進一步激活胰島素信號通路，導致胰島素分泌受損，糖耐量異常，同時作用于Toll樣受體4信號通路，降低LDL的合成，抑制動脈粥樣硬化形成[16]。本研究結果顯示，T2DM+CHD組患者血漿miR-let7b、miR-let7i相對表達量高于T2DM組，提示miR-let7b、miR-let7i可能參與了T2DM患者動脈粥樣硬化的形成，進一步導致CHD。

有學者上調了野生型小鼠中miR-let7f-1的表達，發現小鼠出現胰島素敏感性降低伴胰島素分泌不足，血糖逐漸升高，最終發展為糖尿病[17]。還有研究表明，miR-let7f-1通過與胰島素樣信號通路中的3′UTR位點相結合抑制IGF-1的表達，從而促進動脈粥樣硬化的發生[18]。Zhu等[19]進行小鼠體外研究發現，調節miR-let7g/LIN28通路，增強胰島素-PI3K-mTOR途徑活性和胰島素敏感性，可進一步影響血糖水平。另外一項研究表明，ox-LDL進入血管平滑肌細胞時miR-let-7g表達量減少，可能與ox-LDL誘導細胞增殖、遷移、自噬和凋亡有關;miR-let7g也可直接作用于LOX-1的下游因子Ca2+、PKC和OCT-1，從而調節血脂代謝[20]，最終促進動脈粥樣硬化的形成。本研究結果顯示，T2DM+CHD組血漿miR-let7g、miR-let7f-1相對表達量低于T2DM組，推測血漿miR-let7g、miR-let7f-1表達降低可能通過上述通路導致T2DM合并CHD的發生。

本研究通過ROC曲線分析了血漿miR-let7b、miR-let7i、miR-let7g、miR-let7f-1對T2DM及T2DM+CHD的診斷價值，結果顯示，miR-let7b、miR-let7f-1、miR-let7g、miR-let7i診斷T2DM的AUC分別為0.937 8、0.997 6、0.839 7、0.925 4；miR-let7b、miR-let7f-1、miR-let7g、miR-let7i診斷T2DM+CHD的AUC分別為0.809 1、0.872 7、0.751 5、0.812 1。血漿miR-let7b、miR-let7i、miR-let7g、miR-let7f-1對T2DM及T2DM+CHD均有一定的診斷效能。結合上述結果，我們認為，miR-let7b、miR-let7i表達降低及miR-let7g、miR-let7f-1表達升高均提示T2DM患者有并發CHD的可能。血漿miR-let7檢測為T2DM合并CHD的診斷提供了新思路。