5-HT2A受體激動劑DOI改善糖尿病大鼠排尿障礙的實(shí)驗(yàn)研究

涂紅堅(jiān)　李玉梅　劉斌　魏世杰　谷寶軍

【摘 要】目的：研究5-羥色胺2A（5-HT2A）受體激動劑對糖尿?。╠iabetesmellitus，DM）大鼠排尿功能障礙的改善作用。方法：選擇體重270～300克之間的雌性SD大鼠20只。隨機(jī)分成兩組：實(shí)驗(yàn)組10只，建立糖尿病模型;正常對照組10只。8周后進(jìn)行膀胱內(nèi)壓測定，記錄膀胱內(nèi)壓圖（cystometrograms，CMGs），并且測量膀胱容量、殘余尿量、峰值壓力、排尿量等尿動力學(xué)參數(shù)。靜脈注射5-HT2A受體激動劑（2，5-dimethoxy-4-idophenyl）-2-aminopropanehydrochloride（DOI0.01～0.3mg/kg），得到劑量-效應(yīng)曲線后再給予5-HT2A受體抑制劑酮色林（ketanserin，0.1mg/kg），觀察其對DOI的拮抗作用。結(jié)果：和對照組相比，DM大鼠膀胱容積變大，殘尿量增加，排尿效率降低明顯。DOI則能增加DM大鼠的排尿量，同時(shí)降低膀胱容及殘余尿量，劑量依賴性的提高DM大鼠的排尿效率，同時(shí)DOI能延長其排尿時(shí)CMGs中的高頻振蕩波（high-frequencyoscillations，HFOs）持續(xù)時(shí)間。酮色林（0.1mg/kg）靜推后可以逆轉(zhuǎn)DOI的效應(yīng)。在對照組中，DOI在用藥前后對排尿效率的影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論：DOI可以劑量依賴性地增強(qiáng)DM大鼠排尿時(shí)尿道外括約肌的高頻舒張-收縮功能，從而提高排尿效率，改善排尿功能障礙。

【關(guān)鍵詞】排尿;5-羥色胺受體;糖尿病;大鼠

【中圖分類號】R285.5【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A【文章編號】1005-0019（2019）21--01

糖尿病神經(jīng)源性膀胱（diabetic neurogenic bladder， DNB）是糖尿病常見的慢性并發(fā)癥之一，約40%～80%的糖尿病患者可并發(fā)此癥[1]。目前的觀點(diǎn)認(rèn)為糖尿病神經(jīng)和血管病變是DNB的主要致病因素[2，3]，使得各種感覺、運(yùn)動功能減弱及神經(jīng)反射消失，出現(xiàn)膀胱逼尿肌功能受損、尿道外括約肌弛緩性癱瘓及逼尿肌-括約肌失協(xié)調(diào)（detrusor sphincter dyssyneria， DSD）[4，5]，其中膀胱逼尿肌功能受損包括逼尿肌收縮無力、反射亢進(jìn)及無抑制性收縮等，以逼尿肌收縮無力為主[5，6]。導(dǎo)排尿效率低下，發(fā)生膀胱容量增大及尿潴留，因大量殘余尿和膀胱內(nèi)高壓，進(jìn)一步引起膀胱輸尿管返流，從而損害腎功能。因此，糖尿病引起的排尿障礙的治療關(guān)鍵在于增強(qiáng)逼尿肌收縮力和改善逼尿肌-括約肌功能失協(xié)調(diào)。我們利用SD雌性大鼠作為模型，觀察5-羥色胺（5-hydroxytryptamine， 5-HT）亞型5-HT2A受體激動劑對DNB排尿功能的影響，現(xiàn)報(bào)道如下：

1 對象與方法

1.1 動物分組與糖尿病模型的建立 成年SD雌性大鼠20只，重量270～300g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物公司，隨機(jī)數(shù)字表法分為2組：實(shí)驗(yàn)組10只，建立糖尿病模型;另外10只設(shè)為正常對照組。實(shí)驗(yàn)組和對照組分別禁食12h，實(shí)驗(yàn)組按65mg/Kg劑量腹腔注射1%鏈脲佐菌素（STZ， 美國Sigma公司），對照組用等量生理鹽水代替注射，于注藥后72h及1周后檢查大鼠隨機(jī)血糖，血糖連續(xù)2次超過300mg/dL者為DM模型成功[7]。

1.2 試驗(yàn)方法 ①測定膀胱內(nèi)壓[8]：8周后均進(jìn)行膀胱內(nèi)壓測定。用烏拉坦（1.3g/Kg，美國Sigma公司）腹腔注射麻醉，麻醉成功后，在顯微鏡下將PE-50聚乙烯導(dǎo)管一端置入大鼠左側(cè)頸靜脈，另一端過火封閉;再將PE-90聚乙烯導(dǎo)管置入膀胱頂部，縫線固定，另外一端連接三通管，三通管一端連接微泵注射器持續(xù)注射室溫生理鹽水入膀胱誘發(fā)排尿，另一端連接壓力轉(zhuǎn)換器用于記錄CMGs，灌注速度根據(jù)大鼠膀胱容量確定（DM大鼠0.6ml/min，對照組大鼠0.1ml/min），排出的尿液收集在連接有重力傳感器的容器中。Powerlab多道生理記錄儀（澳大利亞AD Instruments公司）采集數(shù)據(jù)，包括排尿量、殘尿量、膀胱容量、排尿效率（排尿量占膀胱容量的百分比）、膀胱峰值壓力（排尿時(shí)膀胱內(nèi)最大壓力，Peak P），同時(shí)計(jì)算HFOs持續(xù)時(shí)間（t-HFOs）。2.實(shí)驗(yàn)方法：DM組及對照組大鼠均需記錄三次連續(xù)相似的排尿波形，同時(shí)記錄上述各值。然后通過已置入頸靜脈的聚乙烯PE-50導(dǎo)管，注入DOI（美國Sigma公司），劑量從0（空白生理鹽水對照）開始，并連續(xù)追加DOI劑量直至0.3mg/kg，再給予5-HT2A受體選擇性抑制劑酮色林（Ketanserin，美國Sigma公司）0.1mg/kg，記錄上述測壓參數(shù);測壓完成后，從下腹正中切口暴露膀胱，分離結(jié)扎雙側(cè)輸尿管，盡量遠(yuǎn)離膀胱頸部離斷尿道，完整取出膀胱，立即切除膀胱，吸凈水分，電子天平稱重。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)以表示，采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析。兩組大鼠給藥前后尿動力學(xué)參數(shù)的變化比較用隨機(jī)區(qū)組方差分析，兩兩間比較采用LSD檢驗(yàn)，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)組大鼠成模結(jié)果及與對照組差異 實(shí)驗(yàn)組10只大鼠中2只因低血糖而被棄用，8只建模成功。以下為8周后成模DM大鼠和正常對照組大鼠血糖濃度、體重及其膀胱體積等的比較（表1）

2.2 DOI對正常大鼠排尿的影響 對照組大鼠，排尿量為0.38±0.08ml，膀胱容量為0.46±0.08ml，殘余尿量為0.08±0.00ml，膀胱峰值壓力峰值為20.6±4.3cmH2O，平均排尿效率為83.2±3.1%。使用DOI后，隨著劑量的增加，對照組大鼠的排尿量、膀胱容量呈下降趨勢，DOI劑量為0.1和0.3mg/kg時(shí)與生理鹽水組間比較的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而其他值的變化差異無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。酮色林（0.1mg/kg）對正常大鼠的殘尿量、膀胱容積及排尿效率也有一定逆轉(zhuǎn)作用，見表2。

2.3 DOI對DM大鼠排尿的影響

如表3所示，隨著DOI劑量增加，DM大鼠排尿量由1.88±0.05ml增加到2.88±0.43ml，殘余尿量由3.46±0.78ml下降到1.58±0.37ml，膀胱容量由5.20±0.80ml下降到4，46±0.36ml，膀胱峰值壓力由35.5±7.1cmH2O下降到29.3±6.4cmH2O，HFOs持續(xù)時(shí)間由7.1±1.0s上升到9.2±0.9s，且酮色林（KET， 0.1mg/kg）能逆轉(zhuǎn)DOI的作用。DM大鼠排尿效率由35.2±10.5%增加到65.6±8.4%，使用酮色林（KET， 0.1mg/kg）后又下降至36.6±6.8%。DOI劑量為0.03～0.30mg/kg時(shí)，糖尿病大鼠的殘尿量、膀胱容量、排尿效率及膀胱峰值壓力、HFOs持續(xù)時(shí)間的變化與生理鹽水組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），排尿量在DOI劑量為0.1～0.30mg/kg時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.4 DOI對大鼠CMGs的影響

正常大鼠經(jīng)膀胱灌注誘導(dǎo)膀胱收縮時(shí)產(chǎn)生的CMGs如圖1A所示，波形呈鐘形，整體較平滑。正常大鼠排尿時(shí)每個(gè)周期可分為三個(gè)階段：膀胱內(nèi)壓力（intravesical pressure， IVP）上升期;高頻振蕩期（HFOs，圖1B）;IVP再次上升后下降期。HFOs期是尿液排出的主要時(shí)期，且HFOs由多個(gè)小振蕩波組成，波形成鋸齒樣。糖尿病大鼠排尿時(shí)CMGs中HFOs活動減弱且鋸齒樣結(jié)構(gòu)紊亂，小振蕩波振幅減?。▓D1D）。

靜脈給予DOI后，DM大鼠排尿時(shí)HFOs活動呈劑量依賴性增強(qiáng)。排尿時(shí)CMGs上HFOs持續(xù)時(shí)間由7.2±1.0sec增加到9.2±0.9sec，且HFOs的振幅呈濃度依賴性變大，鋸齒樣波形加深，酮色林（KET， 0.1mg/kg）能逆轉(zhuǎn)DOI的作用，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，圖2）。

討論

正常大鼠在儲尿過程中膀胱充盈時(shí)，膀胱逼尿肌開始舒張，尿道外括約肌相應(yīng)收縮，直到膀胱充盈到一定程度開始排尿，膀胱逼尿肌收縮，尿道外括約肌出現(xiàn)協(xié)調(diào)性松弛，故下尿路正常的排尿和儲尿功能依賴于膀胱、尿道外括約肌以及尿道三者的協(xié)同作用[4，9-11]。正常大鼠排尿時(shí)尿道外括約肌的活動為高頻舒張收縮，表現(xiàn)為強(qiáng)直性收縮間出現(xiàn)階段性松弛，使大鼠的尿道能像“泵”一樣有效的排空尿液[12]。

DM成模過程中有2只大鼠出現(xiàn)低血糖，考慮STZ腹腔注射后胰島β細(xì)胞破壞，大量胰島素釋放而引起低血糖[7]。DM引起大鼠下尿路功能損害在STZ腹腔注射后5-10周出現(xiàn)[13]，其引起排尿功能障礙主要由兩部分的原因構(gòu)成：（1）糖尿病導(dǎo)致神經(jīng)和血管發(fā)生病變，使得機(jī)體各種感覺、運(yùn)動功能減弱及神經(jīng)反射消失，引起尿道外括約肌功能失調(diào)，使得排尿時(shí)尿道外括約肌的協(xié)調(diào)性收縮舒張的能力下降，排尿時(shí)出口的阻力增加，因此降低了排尿效率;（2）膀胱逼尿肌收縮無力，王新民等認(rèn)為膀胱逼尿肌收縮和心肌有相似之處，都存在“Starling 機(jī)制”和“球體原理”[14]，即在一定的范圍內(nèi)，隨著膀胱的容積增加，膀胱的收縮力會隨之增大，但超過代償范圍，膀胱收縮出現(xiàn)失代償，收縮力下降。膀胱收縮力下降可進(jìn)一步加重排尿功能障礙，惡化膀胱收縮功能，造成腎臟損害[15]。

本研究結(jié)果顯示，靜脈給予5-HT2A受體激動劑DOI后劑量依賴性的提高了排尿效率。推測其可能的原因?yàn)椋海?）大鼠尿道外括約肌分布有5-HT2A受體[16-19]，DOI部分恢復(fù)了DM大鼠排尿時(shí)尿道外括約肌的階段性松弛，相對延長了排尿過程中尿道外括約肌“開放”的時(shí)間，尿動力學(xué)上表現(xiàn)為高頻振蕩波的活動增強(qiáng)，HFOs的持續(xù)時(shí)間延長; （2）同時(shí)不能排除DOI對膀胱收縮的直接興奮作用，因?yàn)?-HT2A受體激活后能加強(qiáng)離體狀態(tài)下膀胱肌條的收縮力[20]。

膀胱峰值壓力的水平可以反映膀胱收縮力的高低，理論上DOI可使膀胱峰值壓力增高，但本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，DOI能劑量依賴性的降低膀胱峰值壓力。這并不矛盾，因?yàn)镈OI能促進(jìn)尿道外括約肌的松弛，使得出口的阻力降低，“泵”樣作用增強(qiáng)，膀胱僅需要更小的收縮力就能將尿液排出。此作用可被5-HT2A受體拮抗劑酮色林逆轉(zhuǎn)，進(jìn)一步提示大鼠排尿時(shí)尿道外括約肌出現(xiàn)階段性松弛很可能取決于下行5-HT對5-HT2A受體的作用，而DM大鼠與正常大鼠尿道外括約肌5-HT2A受體分布的差異則需要更加深入的分子水平研究予以證明。

正常大鼠使用DOI后，大鼠膀胱容量呈劑量依賴性減小，這可能是由于5-HT2A受體激動劑能夠促進(jìn)排尿反射，使膀胱容量閾值下降。然而，DOI對正常大鼠排尿時(shí)HFOs的活動影響甚微，且正常大鼠的排尿效率并未發(fā)生明顯變化。正常大鼠尿道外括約肌高頻舒張收縮活動已經(jīng)能夠有效完成正常排尿，因此DOI對正常大鼠膀胱壓力基本無影響。正常大鼠在給藥前，已經(jīng)存在良好的尿道外括約肌高頻舒張收縮活動，如果完全阻斷尿道外括約肌的收縮以延長松弛時(shí)間，反而損失了尿道的“泵”樣作用，故不能提高排尿效率。

本實(shí)驗(yàn)研究表明，5-HT2A受體激動劑DOI可改善DM大鼠的排尿功能障礙，提高排尿效率。而DOI能否改善DNB病人的排尿功能，提高其生活質(zhì)量，則需要更加深入的研究。

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