高效液相色譜法測定復(fù)方氯霉素水楊酸酊中氯霉素及水楊酸含量的方法學(xué)建立與驗證

劉曉強 張巖琛

高效液相色譜法（high-performance liquid chromatography, HPLC）為常用分離和檢測手段，在有機化學(xué)、生物化學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥物學(xué)與檢測、化工、食品科學(xué)、環(huán)境監(jiān)測、商檢和法檢等方面均有廣泛應(yīng)用[1]。其儀器配置包括色譜泵及控制器、色譜柱、檢測器、進樣器、數(shù)據(jù)處理及控制[2]，具有適用性廣、分析速度快、分離效率高、檢測靈敏度高、檢測自動化、樣品回收利用簡單等特點[3]，有著廣泛的應(yīng)用前景。

復(fù)方氯霉素水楊酸酊是一種醫(yī)院制劑，與藥廠制劑比較，具有密切結(jié)合臨床、適應(yīng)性強、高度靈活性、治療作用明確、專科特色強、不良反應(yīng)少等優(yōu)點[4]。其主要成分包括氯霉素和水楊酸，為無色或微黃色澄清透明液體，需要遮光、密封貯存。氯霉素為廣譜抑菌劑，抑制革蘭陰性菌的作用強于革蘭陽性菌，也是治療厭氧菌感染的特效藥物之一，其次用于敏感微生物所致的各種感染性疾病的治療。水楊酸是一種脂溶性有機酸，刺激性大，僅外用，具有抗真菌及溶解角質(zhì)作用，可沿分泌油脂的皮脂腺滲入毛孔深層，溶解毛孔內(nèi)陳舊堆積的角質(zhì)層，改善毛孔粗大情況。復(fù)方氯霉素水楊酸酊是一種皮膚外用藥，臨床主要用于痤瘡、毛囊炎、脂溢性皮炎、酒糟鼻及頭皮糠疹的治療，局部用藥可達(dá)到非常理想效果[5-8]。

采用滴定法測定制劑中水楊酸的含量誤差來源廣泛，且結(jié)果受操作人員影響較大[9]，且已有文獻(xiàn)[10-11]采用 HPLC同時測定制劑中氯霉素和水楊酸含量的報道。本研究就采用 HPLC同時測定復(fù)方氯霉素水楊酸酊中氯霉素和水楊酸的含量的可行性進行分析。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀（品牌Waters，型號2695；品牌島津，型號LC-20AD；品牌Agilent，型號1200）；色譜柱：C18-15-H（Hibar-C18, Merk, 4.6×250 mm,5 μm）、C18-30-H（Symmetry-C18, Waters, 4.6×150 mm, 5 μm）、C18-37-H（ZORBAX Extend-C18,Agilent, 4.6×250 mm, 5 μm）；電子天平（Mettler Toledo，型號 PB602-N/1203010201，唯一性標(biāo)識DZTP-07-H；Mettler Toledo，型號XP205/B209739832，唯一性標(biāo)識DZTP-20-H）。

1.2 試藥

氯霉素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號130555-201203，含量99.8%）；水楊酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號100106-201605，含量99.3%）；氯霉素二醇物對照品（中國食品藥品檢定研究院，130436-200302）。乙腈為色譜純，其他試劑為分析純，水為純化水。復(fù)方氯霉素水楊酸酊。

2 溶液的制備

供試品溶液及對照品溶液應(yīng)臨用新制。

2.1 對照品溶液

分別精密稱取氯霉素對照品和水楊酸對照品適量（10 mg氯霉素、水楊酸加甲醇1 ml）使溶解，用流動相制成每毫升中含100 μg氯霉素、200 μg水楊酸的溶液，作為對照品溶液。

2.2 供試品溶液

精密量取氯霉素水楊酸酊10 ml至100 ml容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻。再精密量取5 ml至50 ml容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2.3 定位溶液

精密稱取10 mg氯霉素二醇物對照品、10 mg氯霉素對照品和20 mg水楊酸對照品至100 ml容量瓶中，加入少量流動相，超聲使其溶解，用流動相稀釋至刻度，搖勻，作為定位溶液。

3 方法學(xué)驗證

3.1 色譜條件

色譜柱：用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以0.01 mol/L庚烷磺酸鈉緩沖溶液（取磷酸二氫鉀6.8 g，用 0.01mol/L庚烷磺酸鈉溶液溶解并稀釋至1000 ml，再加三乙胺5 ml，混勻，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至 2.5）—乙腈（75：25）為流動相；流速為 1.0 ml/min；檢測波長為278 nm，柱溫為30 ℃；進樣量10 μl。

3.2 檢測波長的確定

本實驗利用二極管陣列檢測器，對氯霉素和水楊酸在210～400 nm波長處進行掃描，其中氯霉素的最大吸收波長為278 nm，水楊酸的最大吸收波長為234 nm和298 nm。由于氯霉素與水楊酸含量比較較少，所以為了提高氯霉素的靈敏度，更好地兼顧氯霉素和水楊酸的檢測需求，所以選擇278 nm作為檢測波長。見圖1～2。

3.3 系統(tǒng)適用性實驗

取定位溶液、溶解溶劑和稀釋溶劑，在“3.1”項色譜條件下進樣分析，記錄色譜。出峰的時間順序分別是氯霉素二醇物（3.395 min）、水楊酸（8.672 min）、氯霉素（10.653 min）。各峰之間的分離度均大于2.0。見圖3～4，表1。

3.4 線性關(guān)系實驗

3.4.1 溶液配制精密稱取氯霉素對照品 25 mg和水楊酸對照品50 mg，置于25 ml量瓶中，加入少量甲醇和流動相，超聲使其溶解，用流動相稀釋至刻度，搖勻，得儲備溶液。精密量取儲備溶液5 ml至20 ml容量瓶得濃度為氯霉素250 μg/ml水楊酸500 μg/ml的①號溶液；精密量取儲備溶液3 ml至25 ml容量瓶得濃度為氯霉素120 μg/ml水楊酸240 μg/ml的②號溶液；精密量取儲備溶液5 ml至50 ml容量瓶得濃度為氯霉素100 μg/ml水楊酸200 μg/ml的③號溶液；精密量取儲備溶液2 ml至25 ml容量瓶得濃度為氯霉素80 μg/ml水楊酸160 μg/ml的④號溶液；再精密量取上述③號溶液5 ml至10 ml容量瓶得濃度為氯霉素50 μg/ml水楊酸100 μg/ml的⑤號溶液，分別用流動相稀釋至刻度，搖勻。按“3.1”項色譜條件下，依次進樣10 μl，測定峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)，氯霉素及水楊酸的濃度為橫坐標(biāo)，分別進行線性回歸。

圖1 氯霉素波長吸收

圖2 水楊酸波長吸收

圖3 流動相溶液色譜圖

圖4 系統(tǒng)適用性溶液色譜圖

表1 系統(tǒng)適用性實驗結(jié)果

3.4.2 測定結(jié)果得到氯霉素和水楊酸的回歸方程分別為氯霉素：Y=16 259X+ 87 826（r=0.999 8）；水楊酸：Y=5 323.1X+ 38 341（r=0.999 9）。結(jié)果表明，氯霉素在52.95～264.77 μg/ml和水楊酸在102.60～512.98 μg/ml范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。見表2～3。

3.5 精密度實驗

3.5.1 溶液配制取氯霉素和水楊酸線性關(guān)系項下⑤號溶液即對照品溶液，在“3.1”項色譜條件下重復(fù)進樣6次，測定峰面積。

表2 氯霉素線性關(guān)系實驗結(jié)果

表3 水楊酸線性關(guān)系實驗結(jié)果

3.5.2 測定結(jié)果氯霉素和水楊酸的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD)分別為0.57%和0.64%。見表4～5。

3.6 對照品穩(wěn)定性實驗

3.6.1 溶液配制取氯霉素和水楊酸線性關(guān)系項下⑤號溶液即對照品溶液，在“3.1”項色譜條件下，在室溫下分別于0、6、14、27 h進樣10 μl，記錄其峰面積。

表4 氯霉素精密度實驗結(jié)果(n=6)

表5 水楊酸精密度實驗結(jié)果(n=6)

3.6.2 測定結(jié)果對照品室溫條件下至少在27 h內(nèi)穩(wěn)定。見表6～7。

表6 氯霉素對照品穩(wěn)定性實驗結(jié)果

表7 水楊酸對照品穩(wěn)定性實驗結(jié)果

3.7 膜吸附實驗

3.7.1 溶液配制精密量取復(fù)方氯霉素水楊酸酊10 ml至100 ml容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻。再精密量取5 ml至50 ml容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，濾過0 ml、2 ml、4 ml、6 ml、8 ml在“3.1”項色譜條件下分別進樣，測定峰面積。

3.7.2 測定結(jié)果實驗數(shù)據(jù)顯示可能存在膜吸附，建議棄去至少2 ml初濾液。見表8～9。

表8 氯霉素膜過濾實驗結(jié)果

表9 水楊酸膜過濾實驗結(jié)果

3.8 耐用性實驗

3.8.1 溶液配制分別改變色譜條件中柱溫（25 ℃、30 ℃、35 ℃）、流速（0.8 ml/min、1.0 ml/min、1.2 ml/min）以及水相 pH（2.3、2.5、2.7），在同一臺高效液相色譜儀用同一種色譜柱，以及改變儀器改變色譜柱，用系統(tǒng)適用性溶液作為供試品溶液，在上述不同條件下分別取10 μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

3.8.2 測定結(jié)果各峰之間的分離度均大于2.0，表明本方法耐用性良好。見圖5～10，表10～13。

3.9 重復(fù)性實驗

圖5 柱溫25 ℃系統(tǒng)適用性

圖6 柱溫35 ℃系統(tǒng)適用性

表10 改變柱溫實驗結(jié)果

圖7 流速0.8 ml/min系統(tǒng)適用性

圖8 流速1.2 ml/min系統(tǒng)適用性

表11 改變流速實驗結(jié)果

圖9 水相pH2.3系統(tǒng)適用性

圖10 pH2.7系統(tǒng)適用性

表12 改變水相pH實驗結(jié)果

表13 改變儀器、色譜柱實驗結(jié)果

3.9.1 溶液配制精密量取復(fù)方氯霉素水楊酸酊10 ml至100 ml容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻。再精密量取5 ml至50 ml容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻。取同一批復(fù)方氯霉素水楊酸酊平行配制6份。在“3.1”項色譜條件下分別進樣。

3.9.2 測定結(jié)果氯霉素的含量為97.25%，RSD為0.37%；水楊酸的含量為97.90%，RSD為0.44%，均不超過2.0%。見表14～15。

表14 氯霉素重復(fù)性實驗結(jié)果(n=6)

表15 水楊酸重復(fù)性實驗結(jié)果(n=6)

3.10 回收率實驗

3.10.1 溶液配制分別精密量取 10 ml同批次的復(fù)方氯霉素水楊酸酊至3個100 ml容量瓶中，精密稱取氯霉素對照品約1 g和水楊酸對照品約2 g至10 ml容量瓶中，加入少量甲醇和流動相，超聲使其溶解，用流動相稀釋至刻度，搖勻，再分別精密量取 800 μl、1000 μl、1200 μl至之前的 3 個 100 ml容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，再分別精密量取5 ml置50 ml量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻。在“3.1”項色譜條件下分別進樣，計算回收率。

3.10.2 測定結(jié)果氯霉素的平均回收率為 99.7%，RSD為0.35%，水楊酸的平均回收率為99.8%，RSD為0.41%。見表16～17。

表16 氯霉素加樣回收率實驗結(jié)果(n=9)

3.11 含量測定

3.11.1 溶液配制取氯霉素水楊酸酊三批，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，濾過，取續(xù)濾液，按“2.1”項下方法制備對照品溶液，在“3.1”項色譜條件下分別進樣，每批樣品平行配制2份，每份進樣兩針。記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計算。

3.11.2 測定結(jié)果結(jié)果如下，見表18。

表17 水楊酸加樣回收率實驗結(jié)果(n=9)

表18 氯霉素、水楊酸含量測定實驗結(jié)果(%)

4 討論

本研究采用 HPLC能夠同時測定氯霉素和水楊酸含量，方法簡便、靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

4.1 溶解方法的選擇

本實驗在對照品溶液與供試品溶液中加入甲醇目的是增強溶解，由于甲醇未在水楊酸及氯霉素處出峰，所以可以不用考慮甲醇的干擾。

4.2 流動相體系的優(yōu)化

本實驗采用生產(chǎn)單位制定標(biāo)準(zhǔn)氯霉素含量測定項下用的流動相，當(dāng)水相：乙腈為75：25時，氯霉素和水楊酸峰形好，分離效果好，保留時間適當(dāng)。后期耐用性實驗結(jié)果表明，提高水相pH有助于提高氯霉素和水楊酸的分離度，并且可通過增加有機相比例以縮短分析時間，增加工作效率，但是由于時間限制，未能對流動相的配比對兩主峰的分離度及保留時間的影響進行深入研究，同時也未能探討在不同pH值流動相中樣品及對照品溶液的穩(wěn)定性，之后可以對這方面進一步地探討。

綜上所述，本實驗采用 HPLC成功實現(xiàn)了復(fù)方氯霉素水楊酸酊中氯霉素和水楊酸的含量測定，本法操作簡便、準(zhǔn)確、靈敏度高、專屬性強、干擾小，并且實驗驗證了該法對氯霉素和水楊酸含量測定的準(zhǔn)確性和可靠性，對復(fù)方氯霉素水楊酸這種醫(yī)院制劑的的安全性、有效性起到了保證作用，為進一步提升復(fù)方氯霉素水楊酸酊質(zhì)量提供依據(jù)。