同種異體脂肪干細胞聯合自體富血小板血漿凝膠修復大鼠皮膚軟組織創面的臨床效果

陳杏綺 羅志軍 殷安柱 田 舉 王和庚

傷口愈合是一種相互協調的動態組織修復過程，涉及多種細胞、生長因子、細胞因子等的相互作用，如何在微創或無創情況下促進傷口再生修復是目前醫學領域研究的重點課題之一。脂肪干細胞（ADSCs）和富血小板血漿（PRP）是現階段修復皮膚創面損傷的常用治療技術，前者對真皮細胞外基質膠原的合成有著明顯的刺激作用，可加快皮膚創面愈合速度；后者常用于抑制血管病變、促進組織修復和減輕炎癥反應方面，同樣有利于皮膚創面愈合[1-4]。然而現階段這兩種材料聯合應用于創面愈合的臨床研究較為少見[5]。本研究就同種異體ADSCs聯合自體富血小板血漿凝膠對大鼠皮膚軟組織創面的修復效果進行分析。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

40只SD大鼠，體重220～270 kg，購自中山市人民醫院實驗動物中心，自由進食進水，室溫和濕度分別控制在20～24 ℃和60%～80%。麻醉藥物為戊巴比妥鈉，檢測儀器包括全自動生化分析儀、真空采血管、巴氏管。

1.2 方法

動物模型建立和分組：術前3 d將大鼠背部鼠毛剔除，麻醉方式為40 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射，于大鼠背部行3 cm×3 cm全層皮膚缺損創面。將40只SD大鼠隨機分為A組、B組、C組與D組，每組10只。

處理：A組創緣局部注射異體ADSCs懸液聯合自體PRP，B組創緣局部注射異體ADSCs懸液，C組創緣局部注射自體PRP，D組采用0.9%氯化鈉注射液靜脈注射方式。（各組均在經碘仿與乙醇消毒后，對背部皮膚進行切除，形成創面，之后進行藥物注射，1次/d，共治療14 d。）

ADSCs原代細胞分離、培養與傳代：對大鼠腹部脂肪組織進行體外分離培養，達到某種程度后實施培養擴增，取第3代ADSCs進行誘導分化實驗對系間充質干細胞予以鑒別，適當擴充第3代ADSCs數量，為實驗開展做好準備。

自體大鼠PRP分離、提取和保存：用含有ACD-A抗凝劑的真空采血管抽取7 ml靜脈血，以1 500 r/min離心20 min，將上層血漿及鄰近界面1 mm處的紅細胞用巴氏管吸取至其他離心管中，以2 000 r/min離心10 min；底部薄層的白膜樣物質為血小板沉積層，上方為血漿層，將大部分血漿吸取后，留下約0.5 ml血漿及血細胞成分；靜置30 min后，輕晃離心管，直至紅細胞與血小板在血漿中重懸，將得到的 PRP置于4 ℃冰箱中保存。

1.3 觀察指標

比較 4組大鼠創傷面面積、創面愈合時間、微血管計數CD31細胞陽性表達率、Ⅰ型膠原蛋白含量和創面組織的轉化生長因子-β1（TGF-β1）表達情況。分別在治療3 d、7 d和14 d后，在大鼠創面表面覆蓋透明薄膜，記錄創面面積，根據美國國立衛生院研制出的Image J醫學圖像分析軟件進行創面面積的計算[6]。CD31+、Ⅰ型膠原蛋白含量分別采用蘇木精-伊紅染色法（HE染色）和天狼星紅染色法檢測，采用逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測 TGF-β1表達情況。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 4組創面面積比較

治療3 d后，各組大鼠創面面積均有所減小，A組創面面積明顯小于 D組，差異有統計學意義（P＜0.05）；治療7 d后，A、B、C組大鼠創面面積均明顯縮小，與D組大鼠創面面積比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；治療14 d后，A組大鼠創面面積小于其他各組，差異有統計學意義（P＜0.05），B、C兩組的創面面積比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 4組大鼠創面面積比較(cm2,±s)

表1 4組大鼠創面面積比較(cm2,±s)

注：與D組比較，aP＜0.05；與A組比較，bP＜0.05

組別 動物數 3 d后 7 d后 14 d后A組 10 2.68±0.21a 1.12±0.16a 0.08±0.02 B 組 10 2.95±0.18 1.51±0.18a 0.24±0.05b C 組 10 2.98±0.24 1.64±0.20a 0.30±0.06b D組 10 3.45±0.14 2.69±0.25 0.61±0.15b F值 26.623 112.133 70.669 P值 0.000 0.000 0.000

2.2 4組創面完全愈合時間比較

A、B、C組大鼠創面愈合時間均明顯短于D組，差異有統計學意義（P＜0.05）；B、C兩組大鼠創面愈合時間比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 4組大鼠創面完全愈合時間比較(d,±s)

表2 4組大鼠創面完全愈合時間比較(d,±s)

注：與D組比較，aP＜0.05

組別 動物數 創面愈合時間A組 10 17.95±1.43a B組 10 18.26±1.54a C組 10 18.86±1.32a D組 10 23.15±1.28 F值 30.199 P值 0.000

2.3 4組微血管計數CD31細胞陽性表達率比較

治療前，4組大鼠的微血管計數CD31細胞陽性表達率比較差異無統計學意義（P＞0.05）；治療后，各組大鼠微血管計數 CD31細胞陽性表達率均明顯上升，A組大鼠微血管計數CD31細胞陽性表達率明顯高于B、C、D組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表3、圖1。

2.4 4組Ⅰ型膠原蛋白和創面組織的TGF-β1表達率比較

4組大鼠接受治療前的Ⅰ型膠原蛋白含量和創面組織的 TGF-β1表達率比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；治療7 d和治療14 d后，4組的Ⅰ型膠原蛋白含量和創面組織的TGF-β1表達率比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表4。

表3 4組大鼠微血管計數CD31細胞陽性表達率比較(%,±s)

表3 4組大鼠微血管計數CD31細胞陽性表達率比較(%,±s)

注：與A組比較，aP＜0.05

組別 動物數 治療前 治療14 d后A組 10 40.28±3.24 82.35±3.28 B組 10 39.75±0.15 69.45±4.75a C組 10 40.42±3.18 67.86±5.12a D組 10 39.92±3.27 59.72±4.35a F值 0.094 44.693 P值 0.963 0.000

3 討論

現階段針對皮膚軟組織創面的修復技術，包括植皮、皮瓣等，存在供皮區、供瓣區選擇及局部破壞，移植區皮片、皮瓣成活情況不穩定等局限性。現有皮膚缺損創面外科修復方案存在一定缺陷，傳統換藥方式治療創面起效慢，恢復周期長，傷口不易愈合，新技術修復效果尚未形成定論[7-9]。為探討治療該皮膚創面的有效治療方案，一些醫院采用組建大鼠模型的方式對該疾病的治療展開探討[10]。

干細胞存在于多種成熟組織中，對組織創傷有著明顯的修復作用，將其從脂肪組織中進行分離的技術已有數十年歷史，近年來已應用于臨床中。ADSCs是從脂肪組織中分離而來，為具有多項分化潛能的干細胞，體外可繼續穩定增殖，死亡率極低，具有良好的自我復制與多向分化能力，是人體組織器官的重要組成部分。在條件允許情況下，ADSCs可分化為骨細胞、軟骨細胞等間質類細胞[11-12]。臨床研究發現，ADSCs在皮膚創面修復過程中能夠為血管的生成提供生長因子，也可促進抗凋亡細胞因子生成，加快創面愈合速度[13-14]。ADSCs還能夠調節局部細胞對創傷的反應，增強組織修復，促進創面愈合。PRP是離心全血后得到的血小板濃縮物，其中富含血小板、血漿和生長因子，各種生長因子間有著良好的協同作用，可彌補單一生長因子刺激創面修復不佳的缺點，在促進新生血管再生過程中發揮著重要作用[15]。PRP中含有大量膠原蛋白，可收縮創面，刺激軟組織再生，促進傷口早期閉合和防止感染。TGF-β在細胞增殖、分化和外基質分泌中發揮著重要作用，也可促進生物體免疫調節、胚胎發育、血管形成和創傷愈合的重建。同種異體ADSCs聯合自體PRP可在治療前期提高TGF-β表達，促進創面愈合，治療后期表達率的下降可使瘢痕組織形成風險下降[16-19]。

表4 4組大鼠Ⅰ型膠原蛋白含量和創面組織的TGF-β1表達率比較(±s)

表4 4組大鼠Ⅰ型膠原蛋白含量和創面組織的TGF-β1表達率比較(±s)

Ⅰ型膠原蛋白(μg/L) TGF-β1表達率(%)組別 動物數 治療前 治療7 d 治療14 d 治療前 治療7 d 治療14 d A 組 10 0.28±0.05 1.21±0.14 2.35±0.42 60.48±2.15 81.62±3.24 61.28±1.54 B 組 10 0.30±0.05 0.85±0.09 1.72±0.35 61.21±2.52 73.58±3.25 63.12±2.32 C 組 10 0.29±0.06 0.81±0.15 1.64±0.28 60.96±2.78 71.60±2.14 63.98±2.84 D 組 10 0.32±0.04 0.56±0.08 1.24±0.16 61.75±2.44 65.25±1.65 64.78±2.58 F值 1.144 50.665 20.931 0.454 72.225 4.015 P值 0.345 0.000 0.000 0.716 0.000 0.015

異體 ADSCs取自多種同類型大鼠，與同體ADSCs比較，其免疫性低，可誘導免疫耐受，在促進移植動物存活和血管化過程中，不會引發明顯的免疫排斥反應[20-21]。

聯合應用異體ADSCs和自體PRP可充分發揮兩者各自的優勢，既利于新生血管再生，也可加快膠原蛋白分泌，提高組織中的Ⅰ型膠原蛋白含量；自體PRP的存在可促進異體ADSCs增殖、分化、成脂能力，更好地促進創面愈合；但PRP在促進創面愈合中的應用價值仍需展開進一步深入研究[22-24]。

本研究結果顯示，4組大鼠接受治療前的創傷面面積比較差異無統計學意義，4組大鼠治療3 d后、7 d后和14 d后創面面積和創面完全愈合時間比較，差異有統計學意義；治療后，各組大鼠微血管計數CD31細胞陽性表達率均明顯上升，A組大鼠微血管計數CD31細胞陽性表達率明顯高于B、C、D組，差異有統計學意義；治療7 d和治療14 d后，4組的Ⅰ型膠原蛋白含量和創面組織的 TGF-β1表達率比較，差異有統計學意義。

綜上所述，同種異體ADSCs聯合自體PRP治療大鼠創面損傷，既可迅速縮減創傷面面積，縮短創面愈合時間，也在提高創傷大鼠的微血管計數CD31細胞陽性表達率、Ⅰ型膠原蛋白含量，改善創面組織的TGF-β1表達率方面發揮著重要作用，需要更深入的研究，為該技術在臨床的應用中奠定基礎，提高人性皮膚創傷疾病的治療效果。