過表達SPINK5對宮頸癌細胞惡性生物學行為的影響

朱麗娜，王勇，朱月華

(中國人民解放軍陸軍第七十一集團軍醫院，江蘇徐州221116)

據報道，2015年我國新發宮頸癌約9.89萬例，死亡約3.05萬例，已成為僅次于乳腺癌的女性第二高發惡性腫瘤，嚴重威脅女性身心健康和生活質量[1]。盡管目前已經明確HPV為宮頸癌的主要病因，但由于缺少有效的腫瘤早期診斷分子標志物，大多數患者確診時已進入中晚期，治療效果不佳。因此，尋找宮頸癌的早期診斷分子標志物和治療靶點成為近年研究的熱點[2～4]。絲氨酸蛋白酶抑制劑Kazal型5(SPINK5)定位于人染色體5q32，包含15個潛在的功能抑制區域，其編碼蛋白在皮膚及毛發的形態發育和黏膜上皮的抗炎、抗微生物侵襲等過程中發揮重要作用[5，6]。近年越來越多研究發現，SPINK5與惡性腫瘤的發生、發展密切相關，其在食管癌[7]、喉咽鱗癌[8]、口腔鱗癌[9]、膀胱癌[10]、非小細胞癌[11]等組織中低表達，且與患者預后不良有關。提示SPINK5在惡性腫瘤的發生、發展過程中可能發揮抑癌基因作用。但目前鮮見SPINK5在宮頸癌中作用的報道。2016年6月～2018年6月，我們以GEO數據庫為基礎，挖掘出宮頸癌關鍵差異表達基因SPINK5，并探討過表達SPINK5對宮頸癌細胞增殖、凋亡和侵襲的影響。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 人宮頸癌HeLa細胞、人胚腎上皮293T細胞(以下分別稱HeLa細胞、293T細胞)，購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。SPINK5過表達質粒載體(PCDNA 3.1-SPINK5)及對照質粒載體(PCDNA 3.1-NC)，上海吉凱基因醫學科技有限公司。所有引物序列由深圳華大基因科技服務有限公司設計合成。TRIzol、逆轉錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒，美國Thermo Fisher Scientific公司。RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司。GAPDH、SPINK5一抗和HRP標記的山羊抗兔IgG二抗，英國Abcam公司。Lipofectamine2000，美國Invitrogen公司。MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒、Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒，上海碧云天生物技術有限公司。

1.2 宮頸癌組織差異表達基因分析 通過GEO數據庫獲取GSE9750數據集數據。GSE9750數據集包含33例份宮頸癌組織、24例份正常宮頸組織的基因表達譜芯片數據，該芯片類型為Affymetrix Human Genome U133A Array。R語言程序歸一化處理各樣本基因表達值后，以差異倍數>2、P<0.05為標準，篩選差異表達基因。通過STRING version10.5分析差異表達基因的蛋白互作網絡[12]。

1.3 穩定過表達SPINK5宮頸癌細胞構建

1.3.1 細胞培養 將凍存的HeLa細胞、293T細胞快速解凍并轉移至15 mL無菌離心管中，1 000 r/min離心3 min，去除舊的培養基上清，用含10% FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM完全培養基重懸。然后將細胞懸液接種至新的細胞培養瓶中，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養箱中培養。待細胞融合85%左右時，按1∶3傳代。

1.3.2 慢病毒包裝 取傳3代、對數生長期、生長狀態良好的293T細胞，0.25%胰蛋白酶消化，按1×105個/孔接種于6孔板，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養箱中培養，次日更換為不含雙抗、含10% FBS的DMEM完全培養基，當細胞生長融合60%～70%即可用于轉染。分別配制A液(PCDNA3.1-SPINK5或PCDNA3.1-NC質粒載體1.25 μg+psPAX2 0.75 μg+pMD2.G 0.5 μg+Opti-MEM培養基150 μL)和B液(Lipofectamine2000 15 μL+Opti-MEM培養基150 μL)，A液與B液按1∶1混合，吹打混勻，室溫孵育20 min，逐滴加入6孔板中，輕輕搖動混勻。37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養箱中培養6 h，更換新鮮的DMEM培養基。繼續培養16 h更換新鮮的DMEM培養基，再培養24 h收集上清液，1 000 r/min離心5 min，棄去細胞碎片后，用0.45 μm濾器將上清液過濾至離心管中。4 ℃下50 000 r/min離心2 h，獲取濃縮的PCDNA3.1-SPINK5、PCDNA3.1-NC慢病毒沉淀。

1.3.3 細胞轉染 取傳3代、對數生長期、生長狀態良好的HeLa細胞，按6×105個/孔接種于6孔板，分別記為觀察組和對照組，然后置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養箱中培養。次日，更換為不含FBS的DMEM培養基，然后觀察組加入PCDNA3.1-SPINK5慢病毒，對照組加入PCDNA3.1-NC慢病毒，于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養箱中培養2 h，更換為含10%FBS的DMEM培養基繼續培養。繼續培養48 h，加入含400 μg/mL的G418完全培養基篩選，每2天更換一次新的篩選培養基，篩選培養2周，獲得穩轉細胞株。

1.3.4 轉染效率鑒定 ①SPINK5 mRNA表達檢測：采用實時熒光定量PCR法。收集兩組穩轉細胞，TRIzol法提取細胞總RNA，按逆轉錄試劑盒說明將總RNA逆轉錄為cDNA。以cDNA為模板，按熒光定量PCR試劑盒說明進行PCR擴增。引物序列：SPINK5上游引物5′-ATAGCCACAGTGTCAGTGCTT-3′，下游引物5′-TGCCTGAAATTCATGGCACAT-3′；GAPDH上游引物5′-TGAAGGTCGGAGTCAACGG-3′，下游引物5′-TCCTGGAAGATGGTGATGGG-3′。PCR反應體系共25 μL：SYBR Premix Ex Taq 12.5 μL，上下游引物各1 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 8.5 μL；反應條件：95℃ 30 s，95 ℃ 5 s、60 ℃ 20 s共40個循環。以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。實驗重復3次，取平均值。②SPINK5蛋白表達檢測：采用Western blotting法。收集兩組穩轉細胞，RIPA裂解液提取細胞總蛋白，經BCA法蛋白定量合格。然后加入5×上樣緩沖液，100 ℃水浴5 min，使蛋白充分變性。取變性蛋白30 μg，SDS-PAGE分離蛋白(5%濃縮膠、8%分離膠)。采用濕轉法將蛋白電泳產物轉印至PVDF膜，5%脫脂奶粉-TBST封閉液室溫封閉1 h，分別加入SPINK5、GAPDH一抗(稀釋比均為1∶2 000)，4 ℃孵育過夜。次日，加入HRP標記的山羊抗兔IgG二抗(稀釋比1∶1 000)，37 ℃恒溫搖床孵育1 h。然后加入ECL超敏發光液至完全覆蓋PVDF膜，ChemiDoc MP多功能成像儀成像。采用Image J軟件分析各蛋白電泳條帶灰度值。以GAPDH為內參，以目的蛋白電泳條帶灰度值與內參蛋白電泳條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達量。實驗重復3次，取平均值。

1.4 細胞增殖活性檢測 采用MTT法。收集兩組上述穩轉細胞，接種于96孔板，每孔2×103個，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養箱中培養。培養0、24、48、72 h時，每孔加入MTT 10 μL，于細胞培養箱內孵育4 h，棄去上清液，加入Formazan溶解液100 μL，充分混勻，直至光學顯微鏡下觀察Formazan全部溶解。酶標儀于570 nm波長處檢測各孔的光密度(OD)值。以OD570值代表細胞增殖活性。

1.5 細胞凋亡檢測 采用Annexin V-FITC/PI雙染法。收集兩組上述穩轉細胞，置于6 cm細胞培養皿中培養48 h，胰蛋白酶消化，1 000 r/min離心5 min，PBS重懸并計數。取重懸細胞1×105個，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入Annexin V-FITC結合液195 μL重懸細胞，再加入Annexin V-FITC 5 μL和PI染色液10 μL，充分混勻。室溫避光孵育20 min，上流式細胞儀檢測。

1.6 細胞侵襲能力檢測 采用Transwell侵襲實驗。Matrigel膠4 ℃過夜融化，用含10% FBS的DMEM培養基按1∶5稀釋后，包被Transwell小室上室的基底膜，然后將Transwell小室置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養箱孵育4～5 h，直至Matrigel膠凝固。收集兩組上述穩轉細胞，用含10% FBS的DMEM培養基制成密度為1×106個/mL的細胞懸液。取細胞懸液150 μL加入Transwell小室上室，下室加入含10% FBS的DMEM培養基750 μL，然后將Transwell小室置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養箱中孵育24 h。取出Transwell小室，PBS沖洗2次，用棉簽輕輕拭去Transwell小室上室未穿膜細胞，4%多聚甲醛固定20 min，0.1%結晶紫染色10 min，倒置顯微鏡下觀察。隨機取6個100倍視野，計數穿膜細胞數。以穿膜細胞數代表細胞侵襲能力。實驗重復3次，取平均值。

2 結果

2.1 宮頸癌組織差異表達基因篩選與蛋白互作網絡分析 在GSE9750數據集中共篩選出665個差異表達基因。差異表達基因的蛋白互作網絡分析發現，以SPINK5為中心，其連接KRT4、CRNN、KLK13等組成核心蛋白互作網絡，故選擇SPINK5進行后續功能研究。

2.2 兩組SPINK5 mRNA和蛋白表達比較 轉染48 h，觀察組與對照組SPINK5 mRNA相對表達量分別為5.87±0.25、1.00±0.09，SPINK5蛋白相對表達量分別為4.37±0.55、1.00±0.13。觀察組SPINK5 mRNA和蛋白相對表達量均明顯高于對照組(t分別為18.02、5.97，P均<0.05)。

2.3 兩組培養不同時間細胞增殖活性比較 見表1。

表1 兩組培養不同時間細胞增殖活性比較

注：與對照組培養同時間比較，*P<0.05。

2.4 兩組細胞凋亡率比較 觀察組與對照組細胞凋亡率分別為(11.82±0.39)%、(4.15±0.22)%。觀察組細胞凋亡率明顯高于對照組(t=29.67，P<0.01)。

2.5 兩組細胞侵襲能力比較 觀察組與對照組穿膜細胞數分別為(54.67±3.48)、(120±6.35)個。觀察組穿膜細胞數明顯低于對照組(t=15.63，P<0.01)。

3 討論

宮頸癌是全球女性常見的一種生殖系統惡性腫瘤。據統計，每年宮頸癌新發病例約50萬例，其中絕大多數在發展中國家。目前，宮頸上皮內瘤變被認為是宮頸癌的癌前病變，從宮頸上皮內瘤變發展至宮頸癌一般要8～10年，這表明宮頸癌的發生、發展是一個復雜的過程[13]。宮頸癌發病的分子機制復雜，涉及致癌基因的激活和抑癌基因的抑制。隨著對宮頸癌發病分子機制的持續研究，越來越多參與宮頸癌發生的基因或蛋白被發現，進而衍生出一些新的治療方法，如靶向治療。利用公共數據庫表達譜數據與臨床數據挖掘宮頸癌形成關鍵作用基因是尋找其致病基因、診斷或治療分子標志物的有效手段[14,15]。鑒于此，本研究通過GEO數據庫中宮頸癌組織及其癌旁組織的基因表達譜數據，獲取差異表達基因，在蛋白互作網絡分析的基礎上，篩選出宮頸癌關鍵差異表達基因SPINK5，并推測SPINK5可能在宮頸癌的發生、發展過程中發揮重要作用。

SPINK5屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑超家族中的膀腺分泌類膀蛋白酶抑制劑家族。近年研究發現，SPINK家族與人類多種疾病特別是惡性腫瘤密切相關。Ida等[16]研究發現，SPINK1能誘導人結腸癌細胞增殖；在通過偶氮甲烷構建的結腸癌小鼠模型中發現，結腸癌組織SPINK3(SPINK1的小鼠同源物)過表達，并且SPINK3雜合子小鼠腫瘤多樣性和腫瘤體積較野生型小鼠明顯降低。這些結果提示，SPINK1/SPINK3能刺激結腸癌細胞增殖，并參與結腸癌的進展。目前，絲氨酸蛋白酶抑制劑Kazal型家族中的SPINK1、SPINK3等與腫瘤關系的研究較多，但SPINK5與惡性腫瘤關系的研究相對較少。Wang等[7]研究發現，在食管癌組織中SPINK5表達明顯降低，且過表達SPINK5能夠抑制食管癌細胞中Wnt/β-catenin信號通路。李崇鑫[11]研究發現，NSCLC組織SPINK5表達明顯高于癌旁正常組織，且在有淋巴結轉移的NSCLC組織中表達更高；進一步分層分析發現，SPINK5主要在有淋巴結轉移的肺腺癌組織中高表達。結果表明SPINK5在NSCLC組織中高表達，且其高表達在淋巴結轉移過程中發揮重要作用。Zhao等[9]研究發現，SPINK5表達與口腔鱗癌患者生存率明顯相關，并認為SPINK5能夠通過DNA甲基化引起的表觀遺傳改變參與口腔鱗癌的發生、發展。但目前鮮見SPINK5表達與宮頸癌關系的報道。

本研究通過慢病毒構建穩定過表達SPINK5的HeLa細胞，發現觀察組SPINK5 mRNA和蛋白相對表達量均明顯高于對照組，表明該技術能夠穩定使HeLa細胞SPINK5過表達。進一步觀察發現，觀察組培養48、72 h細胞增殖活性明顯低于對照組，細胞凋亡率明顯高于對照組，細胞侵襲能力明顯低于對照組，表明SPINK5可能通過促進細胞凋亡而抑制腫瘤生長，進而降低其侵襲能力，與Matsuura等[17]報道基本一致。

綜上所述，SPINK5在宮頸癌組織中低表達；過表達SPINK5能夠抑制宮頸癌細胞增殖和侵襲并促進其凋亡。這為未來宮頸癌靶向治療提供了新的靶點。