多發(fā)性骨髓瘤患者骨髓組織MDR1、CD269表達(dá)變化及其臨床意義

李清平，徐晶，蔣繼貧

(1 荊門市第二人民醫(yī)院，湖北荊門448000；2 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院)

多發(fā)性骨髓瘤(MM)是一種克隆漿細(xì)胞異常增殖性惡性腫瘤，近年來其發(fā)病率逐年升高，已成為血液系統(tǒng)的第二大惡性腫瘤[1]。MM的發(fā)病機(jī)制尚不明確，目前仍被認(rèn)為是不可治愈的疾病之一。多藥耐藥基因1(MDR1)定位于人7號染色體長臂，能夠編碼分子量為170 kD的細(xì)胞膜糖蛋白P-gp。P-gp是一種ATP依賴性跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，具有能量依賴性“藥泵”功能，可將多種結(jié)構(gòu)不同的化合物逆向轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞。因此，MDR1及其編碼蛋白P-gp介導(dǎo)的藥物外排是腫瘤化療多藥耐藥的重要機(jī)制[2，3]。白細(xì)胞分化抗原269(CD269)為B細(xì)胞表面分子，可與B細(xì)胞活化因子和增殖誘導(dǎo)配體(APRIL)結(jié)合，主要在體液免疫中發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)功能。有研究發(fā)現(xiàn)，CD269與APRIL結(jié)合可激活細(xì)胞內(nèi)NF-κB信號通路，能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖并抑制其凋亡[4]。近年研究還發(fā)現(xiàn)，CD269與APRIL結(jié)合激活細(xì)胞內(nèi)NF-κB信號通路后，其下游轉(zhuǎn)錄因子能夠促進(jìn)MDR1表達(dá)[5]。因此，MDR1、CD269有可能參與MM的發(fā)生、發(fā)展，但目前國內(nèi)外報道較少。為此，本研究觀察了MM患者骨髓組織MDR1、CD269表達(dá)變化，并探討其臨床意義。現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2014年1月～2018年6月荊門市第二人民醫(yī)院收治的MM患者106例(觀察組)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合2014年國際骨髓瘤工作組修訂的MM診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，即骨髓單克隆漿細(xì)胞比例≥10%和(或)組織活檢有漿細(xì)胞瘤，血清和(或)尿液出現(xiàn)單克隆M蛋白，伴或不伴靶器官損害；②初診，入院前未接受任何抗腫瘤治療；③一般身體狀況良好；④臨床病理資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他血液系統(tǒng)惡性腫瘤者；②合并其他器官惡性腫瘤、貧血性或免疫性疾病者；③合并心、肝、肺、腎等重要臟器嚴(yán)重功能障礙者；④妊娠期或哺乳期婦女；⑤臨床病理資料不完整者。其中，男65例、女41例，年齡38～73(56.1±6.7)歲；細(xì)胞學(xué)類型：成熟漿細(xì)胞型16例，幼漿細(xì)胞型58例，原漿細(xì)胞型19例，網(wǎng)狀細(xì)胞型13例；臨床分期：Ⅰ、Ⅱ期73例，Ⅲ期33例；根據(jù)《中國多發(fā)性骨髓瘤診治指南》[7]中的療效和臨床復(fù)發(fā)標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)律治療后完全緩解42例、部分緩解31例、疾病穩(wěn)定33例，復(fù)發(fā)15例、未復(fù)發(fā)91例；隨訪截至2019年1月，隨訪時間1～60個月，中位隨訪時間36個月，以中位隨訪時間為界，生存時間<36個月10例、≥36個月96例。同期經(jīng)骨髓穿刺證實(shí)骨髓功能正常的非血液系統(tǒng)疾病患者40例(對照組)，男21例、女19例，年齡38～68(57.0±6.8)歲。兩組性別、年齡具有可比性。本研究經(jīng)荊門市第二人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，患者或其家屬知情同意。

1.2 骨髓組織MDR1、CD269表達(dá)檢測 采用RT-qPCR法。分別取兩組骨髓組織2～4 mL，采用TRIzol法提取骨髓組織總RNA，經(jīng)超微量分光光度計鑒定，OD260/OD280為1.8～2.1，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。按照Fermentas逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，按2×SYBR Green qPCR Msater Mix說明進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所有引物序列由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計合成。引物序列：MDR1上游引物5′-CCAAAGTCAACAAGGAGTGC-3′，下游引物5′-TCTTCAACAGTGGTTTATCGCA-3′；CD269上游引物5′-ATGCAGCTGGCTTCA-3′，下游引物5′-TTCGTGAGTAAGGGG-3′；GAPDH上游引物5′-CCCCTTCATTGACCTCAACTACA-3′，下游引物5′-CGCTCCTGGAGGATGGTGAT-3′。PCR反應(yīng)體系共20 μL：2×Tag PCR Master Mix 10 μL，上下游引物各1 μL，模板cDNA 1 μL，DEPC水7 μL；反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 30 s、60 ℃ 60 s、72 ℃ 45 s共40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 兩組骨髓組織MDR1、CD269表達(dá)比較 觀察組與對照組骨髓組織MDR1相對表達(dá)量分別為11.16±1.32、0.32±0.09，CD269相對表達(dá)量分別為4.17±1.13、0.84±0.08。觀察組骨髓組織MDR1、CD269相對表達(dá)量均明顯高于對照組(t分別為33.854、18.580，P均<0.01)。

2.2 骨髓組織MDR1、CD269表達(dá)與MM患者臨床病理特征的關(guān)系 見表1。

表1 MM患者骨髓組織MDR1、CD269表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.3 MM患者骨髓組織MDR1表達(dá)與CD269表達(dá)的關(guān)系 Pearson相關(guān)分析顯示，MM患者骨髓組織MDR1相對表達(dá)量與CD269相對表達(dá)量呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.688，P<0.01)。

3 討論

MM是一種克隆漿細(xì)胞異常增殖性惡性腫瘤，約占血液系統(tǒng)惡性腫瘤的10%[8]。隨著我國人口老齡化加劇，MM的發(fā)病率有明顯升高趨勢。MM起病隱匿，臨床表現(xiàn)復(fù)雜且缺乏特異性，極易漏診和誤診。目前，MM尚不能治愈，其治療緩解率較低、復(fù)發(fā)率較高且易產(chǎn)生耐藥，預(yù)后較差。

MDR1定位于人7號染色體長臂，能夠編碼分子量為170 kD的細(xì)胞膜糖蛋白P-gp。P-gp是ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族成員之一，能將多種結(jié)構(gòu)不同的化合物逆向轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞。因此，MDR1及其編碼蛋白P-gp介導(dǎo)的藥物外排是腫瘤化療多藥耐藥的重要機(jī)制[2，3]。有研究發(fā)現(xiàn)，在血液系統(tǒng)腫瘤及實(shí)質(zhì)器官腫瘤中MDR1異常高表達(dá)，并且其高表達(dá)與患者預(yù)后不良有關(guān)[9]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，觀察組骨髓組織MDR1相對表達(dá)量明顯高于對照組，表明MDR1可能與MM的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。這可能與MM發(fā)生時HSE、NF-R2等反式作用因子及NF-κB/p65轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物均能調(diào)控MDR1啟動子激活有關(guān)[10，11]。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，骨髓組織MDR1相對表達(dá)量與MM臨床分期和生存時間有關(guān)，而與性別、年齡、細(xì)胞學(xué)類型、是否復(fù)發(fā)無關(guān)，表明MDR1表達(dá)升高可能參與MM的惡性進(jìn)展并導(dǎo)致患者預(yù)后不良。MDR1表達(dá)增加可促進(jìn)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白CNND1表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞持續(xù)增殖，這可能是導(dǎo)致MM惡性進(jìn)展的重要機(jī)制之一[12]。

CD269又稱B細(xì)胞成熟抗原，其基因定位于人染色體16p13，編碼蛋白屬于TNF受體超家族的成員。CD269僅表達(dá)在成熟B細(xì)胞表面，是一種重要的B細(xì)胞生物標(biāo)志物，在B細(xì)胞發(fā)育和自身免疫應(yīng)答中具有重要作用。CD269能夠特異性結(jié)合腫瘤壞死因子配體超家族成員13b，并導(dǎo)致NF-κB和MAPK/JNK信號通路活化，從而促進(jìn)細(xì)胞存活和增殖。研究表明，MM患者骨髓組織CD269表達(dá)明顯升高，并可與APRIL結(jié)合激活下游相關(guān)信號通路，如NF-κB信號通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、遷移等生物學(xué)行為[13]。因此，CD269有可能參與MM的發(fā)生、發(fā)展。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，觀察組骨髓組織CD269相對表達(dá)量明顯高于對照組，表明CD269可能參與MM的發(fā)生、發(fā)展。當(dāng)MM發(fā)生時，骨髓微環(huán)境中CD269的配體APRIL表達(dá)增加，可促進(jìn)CD269表達(dá)及活化，進(jìn)而通過激活下游靶基因，促進(jìn)TGF-β、IL-10等表達(dá)；此外，CD269活化可激活JNK信號通路，進(jìn)一步促進(jìn)MM細(xì)胞增殖，而JNK信號通路激活反過來又促進(jìn)CD269表達(dá)，從而形成正反饋回路[14]。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，骨髓組織CD269相對表達(dá)量與MM臨床分期和生存時間有關(guān)，而與性別、年齡、細(xì)胞學(xué)類型、是否復(fù)發(fā)無關(guān)，表明CD269表達(dá)增加可能促進(jìn)MM的惡性進(jìn)展并導(dǎo)致患者預(yù)后不良。有研究認(rèn)為，CD269表達(dá)增加通過激活MAPK/AKT/NF-κB信號通路，通過上調(diào)CDC25B、ACK1等基因表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，通過下調(diào)BIRC3、MCL1等基因表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，通過上調(diào)VEGFR2、FGFR3等基因表達(dá)促進(jìn)腫瘤血管生成，而用CD269單克隆抗體阻斷其與APRIL結(jié)合，能夠逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為[15]。

有研究發(fā)現(xiàn)，CD269與APRIL結(jié)合激活細(xì)胞內(nèi)NF-κB信號通路后，其下游轉(zhuǎn)錄因子能夠促進(jìn)MDR1表達(dá)[5]，表明MDR1與CD269可能具有一定相關(guān)性。本研究結(jié)果顯示，MM患者骨髓組織MDR1相對表達(dá)量與CD269相對表達(dá)量呈正相關(guān)關(guān)系，說明二者可能協(xié)同參與MM的發(fā)生、發(fā)展，與姜方毅等[16]報道一致。但MDR1與CD269相互作用的具體機(jī)制尚不清楚，仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述，MM患者骨髓組織MDR1、CD269表達(dá)升高，二者可能協(xié)同參與MM的發(fā)生、發(fā)展。