宮頸癌組織lncRNA GAS5、miR-205表達變化及其與患者臨床病理特征的關系

李秀艷，郭麗，卜琦，王玉梅

(1 天津市濱海新區大港醫院，天津300270；2 天津市北辰區中醫醫院；3 天津市第五中心醫院)

宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤之一，全球范圍內每年新發病例超過50萬例、死亡病例超過26萬例[1]。近年來，隨著宮頸細胞學等早期篩查技術的廣泛開展，越來越多的宮頸癌和癌前病變得以早期發現和治療，宮頸癌病死率已有明顯下降趨勢[2]。但晚期宮頸癌患者預后仍然較差，5年生存率不足15%[3]。目前，關于宮頸癌發生、發展的分子機制仍不十分清楚，尚需進一步深入研究。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是長度大于200個核苷酸，具有多種調控功能的一類RNA分子，可通過參與基因表達調控，影響細胞增殖、分化、凋亡及腫瘤形成和惡性進展等生理或病理生理過程。生長阻滯特異性抑制物5(GAS5)屬于lncRNA家族成員之一，定位于人染色體1q25.1，在胚胎和機體成熟組織中廣泛表達，其編碼轉錄本的部分二級RNA結構能夠模擬糖皮質激素反應元件，可與糖皮質激素受體的DNA結合結構域結合，阻止糖皮質激素受體被激活，從而阻止相應靶基因轉錄。近年研究發現，lncRNA GAS5可下調多種組織中癌基因表達，從而影響乳腺癌、宮頸癌等細胞增殖、侵襲和遷移，是一種潛在的腫瘤抑制因子[4，5]。微小RNA(miRNA)是一種長度為20～25個核苷酸的內源性非編碼小分子RNA，以往被認為是轉錄過程中的“分子垃圾”。近年研究發現，成熟的miRNA加入RNA誘導的沉默復合物中，可通過與靶mRNA的不完全堿基配對識別，導致靶mRNA的翻譯抑制或去穩定化，影響基因表達，從而調控腫瘤的發生、發展。miR-205是miRNA家族的重要成員。既往研究發現，miR-205在非小細胞肺癌、子宮內膜癌等組織中異常表達，可通過激活雷帕霉素靶蛋白信號通路，促進基質金屬蛋白酶9表達，進而促進腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移[6]。有研究表明，lncRNA GAS5可作為分子海綿結合miRNA，如miR-196等，從而影響其對靶基因的調控，繼而導致腫瘤惡性進展[7]。但目前lncRNA GAS5、miR-205在宮頸癌發生、發展中作用的報道較少。為此，本研究觀察了宮頸癌組織lncRNA GAS5、miR-205表達變化，并探討其臨床意義。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2016年6月～2017年12月天津市濱海新區大港醫院和天津市北辰區中醫醫院收治的初診宮頸癌患者93例。所有患者經術后組織病理檢查明確診斷。納入標準：①符合宮頸癌診斷；②FIGO分期Ⅰ、Ⅱ期[8]；③均行宮頸癌根治術，術前未接受任何抗腫瘤治療。排除標準：①合并其他臟器惡性腫瘤或心、肝、腎等重要臟器嚴重功能不全者；②術前接受抗腫瘤治療者；③合并急慢性感染性疾病或免疫系統疾病者；④臨床病理資料不完整者。患者年齡31～69歲，其中<45歲26例、≥45歲67例；腫瘤直徑：<4 cm 53例，≥4 cm 40例；組織分化程度：高中分化21例，低未分化72例；FIGO分期：Ⅰ期25例，Ⅱ期68例；腫瘤浸潤深度：<1/2肌層52例，≥1/2肌層41例；有淋巴結轉移38例，無淋巴結轉移55例。本研究經天津市濱海新區大港醫院、天津市北辰區中醫醫院醫學倫理委員會批準，患者或其家屬知情同意。

1.2 lncRNA GAS5、miR-205表達檢測 取手術切除的宮頸癌組織及其配對的癌旁正常組織(距腫瘤組織邊緣1.5～2.0 cm并經組織病理檢查證實為正常宮頸組織)，采用TRIzol法提取組織總RNA，經超微量紫外分光光度計鑒定，OD260/OD280為1.8～2.1，可用于后續實驗。按TaqMan miRNA反轉錄試劑盒說明將總RNA反轉錄為cDNA，反應條件：16 ℃ 30 min、42 ℃ 30 min、85 ℃ 5 min。以cDNA為模板，按SYBR Green熒光定量PCR試劑盒說明進行PCR擴增。lncRNA GAS5、miR-205引物序列由上海生工生物工程股份有限公司設計合成。引物序列：lncRNA GAS5上游引物5′-CTTGCCTGGACCAGCTTAAT-3′、下游引物5′-CAAGCCGACTCTCCATACCT-3′，內參CAPDH上游引物5′-GGGAGCCAAAAGGGTCAT-3′、下游引物5′-GAGTCCTTCCACGATACCAA-3′；miR-205上游引物5′-CCCAAGCTTCTGGGTGGCTGTTTTGAAAAC-3′、下游引物5′-CCGCTCGAGGAAGCACGCACACTCCAGATG-3′，內參U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′、下游引物3′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-5′。PCR反應體系共20 μL：模板cDNA 1 μL，上下游引物各0.5 μL，SYBR Green Premix 8 μL，不含RNase去離子水10 μL；反應條件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s共40個循環(lncRNA GAS5)；95 ℃ 2 min，94 ℃ 15 s、60 ℃ 20 s、72 ℃ 10 s共40個循環(miR-205)。所有反應在ABI 7500型實時熒光定量PCR儀上完成。以CAPDH或U6為內參，采用2-ΔΔCT法計算目的基因相對表達量。實驗重復3次，取平均值。

2 結果

2.1 宮頸癌組織與癌旁正常組織lncRNA GAS5、miR-205表達比較 宮頸癌組織與癌旁正常組織lncRNA GAS5相對表達量分別為0.52±0.17、1.04±0.14，miR-205相對表達量分別為1.12±0.34、0.59±0.12。宮頸癌組織lncRNA GAS5相對表達量明顯低于癌旁正常組織，miR-205相對表達量明顯高于癌旁正常組織(t分別為22.771、14.176，P均<0.05)。

2.2 宮頸癌組織lncRNA GAS5表達與miR-205表達的關系 Pearson相關分析顯示，宮頸癌組織lncRNA GAS5相對表達量與miR-205相對表達量呈負相關關系(r=-0.473，P<0.05)。

2.3 宮頸癌組織lncRNA GAS5、miR-205表達與患者臨床病理特征的關系 宮頸癌組織lncRNA GAS5相對表達量與腫瘤直徑、FIGO分期及淋巴結轉移有關(P均<0.05)，與患者年齡、組織分化程度、腫瘤浸潤深度無關(P均>0.05)；miR-205相對表達量與FIGO分期、淋巴結轉移、腫瘤浸潤深度有關(P均<0.05)，與患者年齡、腫瘤直徑、組織分化程度無關(P均>0.05)。見表1。

表1 宮頸癌組織lncRNA GAS5、miR-205表達與患者臨床病理特征的關系

3 討論

宮頸癌是女性常見的惡性腫瘤之一，其發病率居女性生殖系統惡性腫瘤首位，并呈年輕化趨勢。近年來，隨著宮頸癌篩查、預防及對癌前病變早期診斷技術的不斷發展，患者病死率已有明顯下降趨勢。但對晚期宮頸癌患者，預后仍然較差。因此，進一步闡明宮頸癌發生、發展的分子機制，尋找腫瘤早期診斷的分子標志物和潛在的治療靶點具有重要意義。

在人類基因組中，非編碼序列占97%左右，可表達產生大量非編碼RNA。這些非編碼RNA在細胞生命活動和個體發育等方面發揮重要的調節作用。近年研究發現，在非小細胞肺癌、結直腸癌等組織中存在非編碼RNA異常表達現象，可通過調節癌基因或抑癌基因表達，影響腫瘤的發生、發展，有可能成為某些腫瘤診斷的生物學標志和潛在的治療靶標[9]。lncRNA是長度大于200個核苷酸，具有多種調控功能的一類RNA分子，能夠通過調節染色質重塑、轉錄、轉錄后修飾等生物學過程，參與慢性炎癥、自身免疫性疾病及惡性腫瘤等疾病的發生、發展過程[10]。有研究表明，lncRNA能夠在轉錄和轉錄后水平調控基因表達，通過調控多種靶基因來發揮癌基因或抑癌基因作用，從而影響腫瘤的發生、發展[11]。GAS5屬于lncRNA家族成員之一，定位于人染色體1q25.1。近年研究發現，lncRNA GAS5可通過直接作用或與miRNA相互作用影響靶基因表達，在多種惡性腫瘤中發揮抑癌作用[12]。但lncRNA GAS5在宮頸癌中作用的報道較少。本研究結果發現，宮頸癌組織lncRNA GAS5相對表達量明顯低于癌旁正常組織，表明lncRNA GAS5在宮頸癌中可能亦具有抑癌作用。目前，lncRNA GAS5在宮頸癌中具體的作用機制尚不清楚，可能與lncRNA GAS5基因啟動子甲基化導致基因表達沉默有關；也可能與miRNA可結合于lncRNA GAS5信使RNA，使lncRNA GAS5穩定性下降，從而抑制lncRNA GAS5表達有關[13]。Li等[14]研究發現，lncRNA GAS5過表達能通過調節細胞周期蛋白D1、p21和凋亡蛋白酶激活因子1表達，抑制卵巢癌細胞增殖。本研究結果發現，宮頸癌組織lncRNA GAS5相對表達量與腫瘤直徑、FIGO分期及淋巴結轉移有關，與患者年齡、組織分化程度、腫瘤浸潤深度無關，提示lncRNA GAS5低表達與宮頸癌惡性進展有關，與Li等[14]報道基本一致。

miRNA是一種長度為20～25個核苷酸的內源性非編碼小分子RNA，能夠通過調節靶基因蛋白表達，在機體生長、發育等方面發揮重要調節作用。近年研究發現，miRNA還可作為多種腫瘤早期診斷和預后判斷的生物標志物[15]。miR-205是miRNA家族的重要成員。既往研究發現，miR-205在非小細胞肺癌、子宮內膜癌等組織中異常表達，可通過激活雷帕霉素靶蛋白信號通路，促進基質金屬蛋白酶9表達，進而促進腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移，有望成為腫瘤早期診斷和預后判斷的生物標志物[6，16]。但miR-205在宮頸癌中作用的報道較少。本研究結果發現，宮頸癌組織miR-205相對表達量明顯高于癌旁正常組織，提示miR-205有可能參與宮頸癌的發生、發展，但其具體作用機制尚不清楚。本研究結果還發現，宮頸癌組織miR-205相對表達量與FIGO分期、淋巴結轉移、腫瘤浸潤深度有關，與患者年齡、腫瘤直徑、組織分化程度無關，提示miR-205高表達與宮頸癌惡性進展有關，與Ma等[17]報道基本一致，其作用機制可能與miR-205具有促進上皮間質轉化相關標志物基因的表達有關[18]。

有研究報道，lncRNA SNHG5可作為競爭性內源RNA結合并抑制miR-205表達，進而抑制腫瘤惡性進展，而敲除lncRNA SNHG5表達后miR-205表達升高，則可促進腫瘤惡性進展[19]。本研究相關性分析顯示，宮頸癌組織lncRNA GAS5表達與miR-205表達呈負相關關系，表明lncRNA GAS5亦能通過結合并抑制miR-205表達，進而抑制宮頸癌惡性進展[20]，但二者具體的相互作用機制仍需進一步研究。

綜上所述，宮頸癌組織lncRNA GAS5表達下調、miR-205表達上調，二者共同參與宮頸癌形成和惡性進展。lncRNA GAS5、miR-205有可能成為宮頸癌篩查的生物標志物和治療靶點。