卵巢癌組織lncRNA NEAT1、CtBP2表達(dá)變化及其臨床意義

陸娟，劉晶晶，戰(zhàn)姝妍

(本溪市中心醫(yī)院，遼寧本溪117000)

卵巢癌是一種嚴(yán)重威脅全球婦女健康的惡性腫瘤，在婦科惡性腫瘤中其發(fā)病率居第二位、病死率居第一位。卵巢癌起病隱匿，早期不易被發(fā)現(xiàn)且易轉(zhuǎn)移，患者預(yù)后往往較差[1]。目前，關(guān)于卵巢癌的病因尚不完全清楚。因此，探索卵巢癌形成與惡性進(jìn)展的分子機(jī)制成為當(dāng)前臨床研究的熱點(diǎn)之一。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度超過(guò)200 nt、不具有編碼蛋白質(zhì)功能的RNA分子，而是以RNA的形式在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后等層面調(diào)控基因的表達(dá)，繼而參與機(jī)體一系列的生理和病理生理過(guò)程[2，3]。近年研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中亦具有重要作用[4]，有可能成為某些惡性腫瘤的特異性生物標(biāo)志物和潛在的治療靶點(diǎn)。核富集轉(zhuǎn)錄體1(NEAT1)是一種長(zhǎng)度約3.2 kb的lncRNA，主要富集于細(xì)胞核中，是形成與維持細(xì)胞核亞結(jié)構(gòu)paraspeckle的關(guān)鍵lncRNA。有研究證實(shí)，lncRNA NEAT1可參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程[5]。羧基末端結(jié)合蛋白2(CtBP2)是進(jìn)化上高度保守的輔助轉(zhuǎn)錄抑制因子，能通過(guò)下調(diào)特定的腫瘤抑制因子，參與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[6]。但目前l(fā)ncRNA NEAT1、CtBP2在卵巢癌形成和惡性進(jìn)展中的作用尚不清楚。本研究觀察了卵巢癌組織lncRNA NEAT1、CtBP2表達(dá)變化，并探討其表達(dá)與患者臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2013年3月～2015年12月本溪市中心醫(yī)院收治的卵巢癌患者76例。所有患者經(jīng)術(shù)后組織病理檢查明確診斷。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合原發(fā)性卵巢癌診斷；②根據(jù)病情行全面分期手術(shù)或腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)；③初診，術(shù)前未行任何抗腫瘤治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他部位惡性腫瘤者；②術(shù)前接受抗腫瘤治療者；③年齡>70歲者；④治療依從性差者；⑤術(shù)后失訪或因意外去世者。其中，年齡20～69(54.32±7.18)歲，≤55歲45例、>55歲31例；腫瘤直徑：≤3 cm 42例，>3 cm 34例；病理類型：漿液性51例，黏液性20例，其他5例；FIGO分期：Ⅰ期28例，Ⅱ期33例，Ⅲ、Ⅳ期15例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移53例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移23例。同期選擇本溪市中心醫(yī)院收治的卵巢良性囊腫患者20例，年齡23～70(55.19±6.65)歲。兩組年齡具有可比性。本研究經(jīng)本溪市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者或其家屬知情同意。

1.2 lncRNA NEAT1、CtBP2表達(dá)檢測(cè) 采用RT-PCR法。取手術(shù)切除或剝離的卵巢癌組織與卵巢囊腫組織，液氮下碾磨成粉末，采用TRIzol法提取組織總RNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)鑒定，OD260/OD280為1.8～2.0，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。按照RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit說(shuō)明，將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，按SYBR Green熒光定量PCR試劑盒說(shuō)明進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所有引物由沈陽(yáng)萬(wàn)類生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成。引物序列：lncRNA NEAT1上游引物5′-GGGATGATGCAAACAATTAC-3′，下游引物5′-TACCATACAGAGCAACATAC-3′；CtBP2上游引物5′-ATCCACGAGAAGGTTCTAAACG-3′，下游引物5′-CCGCACGATCACTCTCAGG-3′；GAPDH上游引物5′-CACCCACTCCTCCACCTTTG-3′，下游引物5′-CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3′。PCR反應(yīng)體系共25 μL：2×SYBR Green qPCR Mix 12.5 μL，上下游引物各0.5 μL，模板cDNA 2 μL，去離子水9.5 μL；反應(yīng)條件：95 ℃ 15 min，95 ℃ 15 s、60 ℃ 40 s共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.3 隨訪 卵巢癌患者術(shù)后采用電話或門診等方式定期隨訪，隨訪截至2018年12月，隨訪時(shí)間9～60個(gè)月、中位隨訪時(shí)間33個(gè)月。以卵巢癌組織lncRNA NEAT1或CtBP2相對(duì)表達(dá)量的均數(shù)為截?cái)嘀担哂诮財(cái)嘀禐楦弑磉_(dá)、低于截?cái)嘀禐榈捅磉_(dá)，統(tǒng)計(jì)不同lncRNA NEAT1或CtBP2表達(dá)者生存時(shí)間和生存率。

2 結(jié)果

2.1 卵巢癌組織與卵巢囊腫組織lncRNA NEAT1、CtBP2表達(dá)比較 卵巢癌組織與卵巢囊腫組織lncRNA NEAT1相對(duì)表達(dá)量分別為0.619±0.115、0.079±0.021，CtBP2相對(duì)表達(dá)量分別為0.330±0.066、0.112±0.014。卵巢癌組織lncRNA NEAT1、CtBP2相對(duì)表達(dá)量均明顯高于卵巢囊腫組織(t分別為20.831、14.631，P均<0.01)。

2.2 卵巢癌組織lncRNA NEAT1表達(dá)與CtBP2表達(dá)的關(guān)系 Pearson相關(guān)分析顯示，卵巢癌組織lncRNA NEAT1相對(duì)表達(dá)量與CtBP2相對(duì)表達(dá)量呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.689，P<0.01)。

2.3 卵巢癌組織lncRNA NEAT1、CtBP2表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系 卵巢癌組織lncRNA NEAT1、CtBP2表達(dá)均與腫瘤FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均<0.05)，而與患者年齡、腫瘤直徑、病理類型無(wú)關(guān)(P均>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 卵巢癌組織lncRNA NEAT1、CtBP2表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系

2.4 卵巢癌組織lncRNA NEAT1、CtBP2表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系 以卵巢癌組織lncRNA NEAT1或CtBP2相對(duì)表達(dá)量的均數(shù)為截?cái)嘀担瑢⒒颊叻譃閘ncRNA NEAT1高表達(dá)者34例、低表達(dá)者42例，CtBP2高表達(dá)者35例、低表達(dá)者41例。至隨訪截至日期，lncRNA NEAT1高表達(dá)者與低表達(dá)者生存率分別為47.06%(16/34)、71.81%(31/42)，生存時(shí)間分別為(35.85±3.57)、(52.38±3.06)個(gè)月，lncRNA NEAT1高表達(dá)者生存率和生存時(shí)間均低于lncRNA NEAT1低表達(dá)者(χ2/t分別為5.698、21.731，P均<0.05)；CtBP2高表達(dá)者與低表達(dá)者生存率分別為48.57%(17/35)、73.17%(30/41)，生存時(shí)間分別為(37.54±3.66)、(52.28±3.03)個(gè)月，CtBP2高表達(dá)者生存率和生存時(shí)間均低于CtBP2低表達(dá)者(χ2/t分別為4.842、19.209，P均<0.05)。

3 討論

據(jù)調(diào)查，我國(guó)卵巢癌發(fā)病率占女性惡性腫瘤的第8位，居世界第85位，處于較低水平[7]。但由于卵巢癌病死率較高，5年生存率僅30%左右[8]，故仍然是嚴(yán)重威脅我國(guó)婦女健康的重要疾病之一。近年來(lái)隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)發(fā)展，居民飲食結(jié)構(gòu)和生活方式改變，卵巢癌的發(fā)病率正逐年上升并呈年輕化趨勢(shì)[9]。由于卵巢癌的病因尚不完全清楚，缺少有效的預(yù)防措施。因此，探索卵巢癌形成與惡性進(jìn)展的分子機(jī)制成為當(dāng)前臨床研究的熱點(diǎn)之一。

lncRNA是廣泛分布于真核生物體內(nèi)的一類非編碼RNA，約占轉(zhuǎn)錄本的93%[10]。lncRNA序列長(zhǎng)，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，雖然不編碼蛋白質(zhì)，但特定的lncRNA能夠參與調(diào)控蛋白的轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后表達(dá)[2,3]。NEAT1是近年發(fā)現(xiàn)的一種在人體細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)的lncRNA，是形成與維持細(xì)胞核亞結(jié)構(gòu)paraspeckle的關(guān)鍵lncRNA。有研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA NEAT1可通過(guò)調(diào)控多種基因的表達(dá)，參與機(jī)體的免疫調(diào)控及惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[11～13]。Chai等[14]研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA NEAT1能夠促進(jìn)卵巢癌OVCAR-3細(xì)胞增殖和侵襲，而敲除lncRNA NEAT1的卵巢癌OVCAR-3細(xì)胞增殖和侵襲明顯受到抑制。本研究結(jié)果顯示，卵巢癌組織lncRNA NEAT1相對(duì)表達(dá)量明顯高于卵巢囊腫組織；卵巢癌組織lncRNA NEAT1表達(dá)與腫瘤FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。與Chai等[14]體外研究結(jié)果一致，提示lncRNA NEAT1可參與卵巢癌形成與惡性進(jìn)展。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA NEAT1高表達(dá)者生存率和生存時(shí)間均低于lncRNA NEAT1低表達(dá)者，表明lncRNA NEAT1高表達(dá)與卵巢癌患者預(yù)后不良有關(guān)。因此，lncRNA NEAT1有可能成為預(yù)測(cè)卵巢癌患者預(yù)后的指標(biāo)之一。

CtBP家族因可與E1A蛋白的碳基末端五個(gè)氨基酸序列結(jié)合而得名，在進(jìn)化上高度保守，是一類輔助轉(zhuǎn)錄抑制因子[15]。CtBP家族有多個(gè)亞型，CtBP2是其中的重要一員，基因定位于染色體21q21.3[6]。CtBP2的中心結(jié)構(gòu)域可與煙酰胺腺嘌呤二核苷酸結(jié)合，碳基末端能夠?qū)蜻M(jìn)行翻譯后修飾，氨基末端則可特異性識(shí)別并結(jié)合特定轉(zhuǎn)錄抑制因子，三個(gè)結(jié)構(gòu)域協(xié)同發(fā)揮輔助轉(zhuǎn)錄抑制因子功能[16～18]。近年研究發(fā)現(xiàn)，CtBP2還能參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。Zhang等[19]研究發(fā)現(xiàn)，CtBP2能夠通過(guò)抑制c-Myc信號(hào)通路促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞增殖；而Takayama等[20]研究發(fā)現(xiàn)，CtBP2還能通過(guò)調(diào)控雄激素受體活性促進(jìn)前列腺癌惡性進(jìn)展；Dai等[21]研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)CtBP2能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲。本研究結(jié)果顯示，卵巢癌組織CtBP2相對(duì)表達(dá)量明顯高于卵巢囊腫組織；卵巢癌組織CtBP2表達(dá)與腫瘤FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。與上述文獻(xiàn)[19～21]報(bào)道基本一致，提示CtBP2可參與卵巢癌形成和惡性進(jìn)展。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，CtBP2高表達(dá)者生存率和生存時(shí)間均低于CtBP2低表達(dá)者，表明CtBP2高表達(dá)與卵巢癌患者預(yù)后不良有關(guān)。因此，CtBP2有可能成為預(yù)測(cè)卵巢癌患者預(yù)后的指標(biāo)之一。

Li等[22]研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA NEAT1能夠通過(guò)調(diào)控miR-129/CtBP2軸，增強(qiáng)食管鱗癌細(xì)胞活性并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，卵巢癌組織lncRNA NEAT1表達(dá)與CtBP2表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系。因此推測(cè)，CtBP2可能是lncRNA NEAT1參與卵巢癌發(fā)生、發(fā)展的下游基因位點(diǎn)，但其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

綜上所述，卵巢癌組織lncRNA NEAT1、CtBP2高表達(dá)，二者表達(dá)變化可能協(xié)同促進(jìn)腫瘤惡性進(jìn)展并導(dǎo)致患者預(yù)后不良。lncRNA NEAT1、CtBP2有可能成為卵巢癌早期診斷和預(yù)后監(jiān)測(cè)的生物標(biāo)志物。