SLE全血樣本線粒體功能相關基因的差異表達分析

巴燕娜，袁晴，蘇麗萍，袁志棟，吳振彪

(1 第四軍醫大學西京醫院，西安710032；2 第四軍醫大學)

系統性紅斑狼瘡(SLE)是一種累及多系統、多器官并有多種自身抗體出現的自身免疫性疾病[1]。SLE多發于青年女性，以20～40歲多見，無論是從疾病本身還是由于長期激素治療帶來的不良反應均嚴重影響患者的身心健康，降低其生活質量[2，3]。目前認為，SLE的病因與遺傳因素、環境因素和免疫反應異常等有關，但其發病的確切分子機制尚不完全清楚。線粒體是一種普遍存在于真核細胞中的細胞器，主要功能是通過氧化磷酸化和脂質過氧化反應產生能量。人類的線粒體基因組長度為16 569 bp[4]，能夠編碼2種rRNA、22種tRNA和4種不同呼吸酶復合物(Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ)的13種高度疏水多肽亞單位。近年研究發現，線粒體損傷能夠促進固有免疫系統的異常激活，導致炎癥性疾病和自身免疫性疾病[5]。但目前鮮見線粒體功能相關基因異常表達與SLE關系的報道。2019年4～7月，本研究通過分析SLE全血樣本轉錄組數據，探索了差異表達的線粒體功能相關基因及其涉及的生物學通路，為進一步探索SLE的發病機制提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料 通過NCBI的GEO數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi)下載人類SLE的RNA-seq轉錄組公共數據，ID：GSE72509，測序平臺：Illumina HiSeq 2500。該公共數據集中共有全血樣本117例份，其中SLE樣本99例份、健康對照樣本18例份。線粒體相關基因信息來源于MitoMiner數據庫(MitoMiner4.0v2018JUN)[6]。該數據庫的參考數據集IMPI共收錄了1 626個人線粒體功能相關基因，其中13個為線粒體基因組編碼的基因。本研究稱非線粒體編碼的1 613個線粒體功能相關基因為線粒體相關基因，而NCBI提供的線粒體參考基因組中的37個線粒體相關基因為線粒體基因。線粒體相關基因和線粒體基因統稱為線粒體功能相關基因。

1.2 RNA-seq轉錄組數據處理 RNA-seq原始數據處理：①質量控制：去除每一段測序讀段的接頭序列并過濾rRNA污染和低質量序列；②序列比對：使用GSNAP軟件將序列和參考基因組hg19進行比對；③計算基因表達值RPKM：根據Chepelev等[7]報道的方法計算基因表達的RPKM值。

1.3 RNA-seq轉錄組數據分析 采用t檢驗和差異倍數(FC)法識別線粒體功能相關的差異表達基因譜，差異表達基因的篩選閾值為P<0.05且FC≥1.5。通過R軟件clusterProfiler、topGO、Rgraphviz、pathview和org.Hs.eg.db等程序包對差異表達基因進行GO功能注釋和KEGG功能富集分析。采用Benjamini-Hochberg法對P進行多重檢驗校正并控制錯誤發現率(P.adjust)，滿足P.adjust<0.05的GO術語和KEGG通路具有顯著性。

1.4 蛋白質互作網絡分析 利用在線的基因注釋與分析資源Metascape(http://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)對差異表達的線粒體功能相關基因進行蛋白質互作網絡分析。如果網絡包含3～500個蛋白質，則應用分子復合物檢測算法來識別密集連接的網絡組件[8]。

2 結果

2.1 SLE全血樣本差異表達基因篩選 對SLE、健康對照全血樣本的轉錄組數據進行t檢驗和FC分析，從23 284個基因中篩選出1 478個顯著差異表達的基因，其中表達上調的基因有1 105個、表達下調的基因有373個。差異表達最大的5個上調基因和5個下調基因見表1。這10個差異表達基因可能與SLE的發生、發展有關。

表1 SLE全血樣本差異表達最大的5個上調基因和5個下調基因

2.2 SLE全血樣本差異表達線粒體相關基因分析

2.2.1 SLE差異表達的線粒體相關基因篩選 在1 478個顯著差異表達的基因中，SLE差異表達的線粒體相關基因共40個，其中表達上調的基因26個、表達下調的基因14個。差異表達最大的5個上調基因和5個下調基因見表2。這10個線粒體相關基因的異常表達在SLE發生、發展過程中具有一定作用。

表2 SLE全血樣本線粒體相關基因差異表達最大的5個上調基因和5個下調基因

2.2.2 SLE差異表達線粒體相關基因的注釋與功能富集分析 GO功能注釋分析顯示，這40個SLE差異表達的線粒體相關基因與氨基酸及其衍生物的代謝過程、蛋白質尋靶、信號識別顆粒依賴的靶向膜共翻譯蛋白、靶向膜共翻譯蛋白、蛋白質靶向內質網、細胞內氨基酸催化過程、核轉錄mRNA分解代謝及無義突變介導的降解和蛋白定位至內質網的建立有關。KEGG功能富集分析發現，這40個SLE差異表達的線粒體相關基因與核糖體、氧化磷酸化及甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、精氨酸、脯氨酸代謝有關。

2.2.3 SLE差異表達線粒體相關基因的蛋白質互作網絡 將這40個SLE差異表達的線粒體相關基因提交至已經整合BioGrid[9]、InWeb_IM[10]和OmniPath三個數據庫信息的Metascape中，分析蛋白質互作網絡，得到的網絡包含一些蛋白質子集，這些蛋白質子集成員至少包含一個與其他成員形成物理相互作用的SLE差異表達線粒體功能相關基因。這些SLE差異表達線粒體功能相關基因的蛋白質互作網絡包括如下通路：hsa04260為與心肌收縮有關的KEGG通路，CORUM：306為核糖體和胞質相關的通路，R-HAS-192823為與病毒mRNA翻譯相關的通路。蛋白質相互作用網絡密集連接區中的4個基因(R、RPL34、RPL31和RPS15A)包含的通路：CORUM：306、R-HSA-192823、R-HSA-156902(肽鏈延伸相關的通路)；另外4個基因(COX6C、COX7A1、COX7B和COX7C)涉及的通路：hsa04260通路、hsa00190通路(與氧化磷酸化相關的KEGG通路)和hsa05012通路(與帕金森病相關的KEGG通路)。結果表明，SLE差異表達線粒體相關基因的蛋白相互作用網絡可影響心肌收縮、氧化磷酸化等細胞功能通路。

2.3 SLE全血樣本差異表達的線粒體基因分析

2.3.1 SLE差異表達線粒體基因的鑒定 在1 478個顯著差異表達的基因中，線粒體基因共8個，均為表達下調的基因，其中有6個基因(MT-ND6、MT-CO1、MT-ND1、MT-ATP6、MT-CO3和MT-ATP8)是編碼蛋白質的基因、2個基因(MT-TR、MT-TE)是編碼線粒體tRNA的基因。見表3。

表3 SLE差異表達線粒體基因的相關信息

注：MT-ND6、MT-ND1編碼蛋白NADH還原酶，MT-CO1、MT-CO3編碼蛋白細胞色素C，MT-ATP6、MT-ATP8編碼蛋白ATP酶，MT-TR編碼tRNA中的精氨酸，MT-TE編碼tRNA中的谷氨酸；鏈的類型中，“+”表示該基因所在位置為與mRNA序列(除T代替U)相同的DNA鏈上，“-”表示該基因在合成RNA模板的DNA鏈上。

2.3.2 SLE差異表達線粒體基因的功能分析 GO功能注釋分析顯示，這8個差異表達的線粒體基因與線粒體能量供應、ATP代謝和核苷酸代謝有關。KEGG功能富集分析顯示，這8個線粒體基因與氧化磷酸化、帕金森病等生物學通路有關。GO功能注釋分析和KEGG功能富集分析獲得富集的結果分別有74、9條，其中最顯著的5條GO術語和5條KEGG通路(P.adjust<0.05)見表4。

表4 8個線粒體基因功能注釋和功能富集的結果

3 討論

SLE是一種典型的系統性自身免疫性疾病，其特征是針對核抗原的自身抗體產生和導致慢性全身性炎癥的Ⅲ型超敏反應。SLE的發病機制復雜，是多種基因和環境因素相互作用的結果，從而導致自身抗原暴露、自身抗體產生、慢性炎癥和組織損傷的惡性循環[11]。含有自身抗原的免疫復合物過載和IFN-α有增無減是SLE形成的標志。在細胞死亡過程中，細胞凋亡和中性粒細胞特異性死亡會改變自身抗原。因此，清除各種死亡細胞的能力不足有可能是導致自身抗原暴露于免疫系統的一個重要因素，最終導致自身免疫性疾病。

線粒體是一種普遍存在于真核細胞中的細胞器，主要功能是通過氧化磷酸化和脂質過氧化反應產生能量。研究證實，線粒體損傷與炎癥性疾病和自身免疫性疾病的發生有關。近年越來越多研究表明，線粒體功能障礙在SLE的發病中具有重要作用[12]。因此，進一步研究線粒體的病理生理學機制對闡明SLE發病的分子機制具有重要意義。但目前基于線粒體功能相關基因與SLE關系的報道較少，線粒體功能在SLE發病機制中的作用也一直未受到重視。

本文基于SLE患者和健康對照者全血樣本的轉錄組數據，分析線粒體功能相關基因在SLE中的表達情況，從23 284個基因中篩選出1 478個差異表達顯著的基因，表達上調的基因有1 105個、表達下調的基因有373個。其中，差異表達最大的5個上調基因分別為TXLNG2P、KDM5D、EIF1AY、DDX3Y和RPS4Y1，差異表達最大的5個下調基因分別為LRRC26、PLD5、PRSS35、LINC00226和LOC100132472。這些差異表達的基因可能在SLE的發生、發展過程中具有重要作用。在1 478個差異表達顯著的基因中，篩選出SLE差異表達的線粒體相關基因共40個，表達上調的基因26個、表達下調的基因14個。其中，差異表達最大的5個上調基因分別為USP9Y、MOCS1、ADGB、LPHN2和HOGA1，差異表達最大的5個下調基因分別為EFHD1、RAI14、CYP11A1、CNKSR3和KRT5。在1 478個差異表達顯著的基因中，篩選出線粒體基因8個，均為表達下調的基因，其中6個基因(MT-ND6、MT-CO1、MT-ND1、MT-ATP6、MT-CO3和MT-ATP8)是編碼蛋白質的基因、2個基因(MT-TR、MT-TE)是編碼線粒體tRNA的基因。本研究分別對這些基因進行GO功能注釋分析和KEGG功能富集分析，發現它們與氧化磷酸化、ATP代謝等生物學過程有關。結果表明，線粒體功能相關基因的異常表達與SLE有關，線粒體的能量供應及ATP、核苷酸的代謝與SLE的發生、發展有關。

在線粒體功能相關的差異表達基因中，線粒體基因MT-ND6和MT-ND1的功能以往在SLE相關的研究中已有報道[13]。在SLE患者中，線粒體相關蛋白轉錄本水平降低，這些蛋白可參與電子轉運(MT-ND1、MT-ND6)、氧化磷酸化(ATP6)、mtDNA(TFAM、NRF-1)的復制和轉錄及三磷酸循環中丙酮酸向乙酰輔酶A的轉化。Vyshkina等[14]研究發現，MT-ATP6和MT-ND2基因分別在線粒體基因組9 055、4 917位點的突變與多發性硬化和SLE有關，表明這兩種自身免疫性疾病可能具有相同的線粒體遺傳背景。但迄今為止，SLE相關線粒體基因功能的研究不多。本研究結果發現，SLE相關的8個線粒體基因表達擾動與線粒體氧化磷酸化、能量供應、ATP代謝和核苷酸代謝有關，表明SLE的發病可能伴隨相關代謝的失常，這為揭示SLE的發病機制提供了新的方向。

另外，本研究篩選出的1 478個差異表達基因與DisGeNET數據庫[15]收錄的1 112個SLE相關基因的共同交集有53個。這53個非線粒體相關基因中差異表達最大的上調基因為DKK1、ERVW-1等；差異表達最大的下調基因為TRPC6、HRH4等。研究發現，DKK1表達上調與骨吸收有關，故DKK1可作為評估SLE骨侵蝕潛在的生物標志物[16]；也有研究報道，具有神經精神病學表現的SLE患者細胞中TRPC6活性較高。TRPC6內含子多態性與SLE神經系統疾病的高發病風險相關，可影響免疫細胞功能[17]。研究發現，HRH4的表達模式預示其在炎癥性疾病和免疫性疾病中具有重要作用。HRH4基因拷貝數增多可顯著增加SLE的發病風險，故針對HRH4的靶向治療為自身免疫性疾病提供了新的治療方向[18]。綜合與DisGeNET數據庫比較的結果以及目前SLE相關基因的研究報道，本研究分析的差異表達線粒體功能相關基因具有一定可靠性。后續的研究要進一步確定本研究中線粒體功能相關基因與SLE發病的關系，這將為分析SLE發病機制提供新的思路。

綜上所述，SLE全血樣本中線粒體功能相關基因表達的異常擾動與SLE的發生、發展有關，這將為探索SLE發病的分子機制提供新的思路。但由于本研究樣本量有限，亦未考慮SLE異質性對研究結果的影響，后續研究有待于進一步改進和優化。